Screening for Tumor Microtube-Targeting Drugs Identifies PKC Modulators as Multipotent Inhibitors of Glioblastoma Progression

D Azorín D, Hoffmann DC, Hebach NR, Jung E, Hausmann D, Ratliff M, Hai L, Horschitz S, Jabali A, Osswald M, Karreman MA, Kessler T, Wendler S, Mayer CD, Löb C, Lehnert P, Cebulla G, Reibold D, Khajuria RK, Bordignon P, Moor AE, Holland-Letz T, Reckless J, Ramsden N, Grainger D, Kreshuk A, Koch P, Wick W, Heuer S, Winkler F. 

Cancer Discovery. 2025 Oct 9.  doi: 10.1158/2159-8290.CD-24-0414

영문초록

Glioblastomas are incurable primary brain tumors that depend on neural-like cellular processes, tumor microtubes (TMs), to invade the brain. TMs also interconnect single tumor cells to a communicating multicellular network that resists current therapies. Here, we developed a combined, comprehensive in vitro/in vivo anti-TM drug screening approach, including machine-learning-based analysis tools. Two Protein Kinase C (PKC) modulators robustly inhibited TM formation and pacemaker tumor cell-driven, TM-mediated glioblastoma cell network communication. Since TM-unconnected tumor cells exhibited increased sensitivity to cytotoxic therapy, the PKC activator TPPB was combined with radiotherapy, and long-term intravital 2-photon microscopy paired with spatially resolved multiomics revealed anti-TM and anti-tumor effects. TPPB treatment also decreased the expression of tweety family member 1 (TTYH1), a key driver of invasive TMs. Our study establishes a novel screening pipeline for anti-TM drug development, identifies a TM master regulator pathway, and supports the approach of TM targeting for efficient brain tumor therapies.

한글초록

교모세포종(glioblastomas, GBs)은 치료 불가능한 뇌종양으로, 뇌 침윤과 치료 저항성을 위해 tumor microtubes(TMs)에 의존하며 TMs은 개별 종양 세포를 연결하는 다세포 네트워크를 형성한다. 본 연구는 머신러닝 기반 in vitro/in vivo anti-TM 약물 스크리닝 접근법을 개발해 Protein Kinase C(PKC) 조절제 두 가지(TPPB, PMA)를 발견했으며, 이들은 TM 형성 억제와 pacemaker 종양 세포 주도의 TM 매개 칼슘 네트워크 통신 차단을 유발한다. TM 비연결 세포의 세포독성 치료 감수성 증가를 이용해 TPPB를 방사선 치료(RT)와 병용, 장기 intravital 2-photon imaging과 spatial multiomics로 anti-TM 및 anti-tumor 효과 확인을 하였다. TPPB는 TM 주요 드라이버 TTYH1 발현도 감소시켰다. 이 연구는 anti-TM 약물 개발 신규 파이프라인 확립, TM 마스터 조절 경로 식별, TM 타겟팅 치료 전략을 제시한다.

논문요약

a.     Introduction: 교모세포종은 공격적 성장과 모든 표준 치료(수술, RT, temozolomide)에 대한 저항성으로 악명 높다. Cancer Neuroscience 분야에서 뉴런-종양 시냅스/파라크린 상호작용 외에 암세포 내재 neuronal 메커니즘(침윤, 증식, 전뇌 침윤)이 핵심이며, TM(10μm~mm 길이, 0.5-2μm 직경, actin/microtubule-rich)은 neurites 유사 구조로 뇌 스캔/침윤/핵 이동/ Cx43 갭 접합 네트워크 형성을 담당한다. TM 네트워크는 pacemaker-like 세포 주도 Ca2+ transient로 성장 자극 신호 전달, TTYH1/GAP43 등 neurodevelopment 드라이버 발현과 관련이 있고 neuron-cancer synapse 대부분 TM 위치로 dendritic 역할을 한다.

b.    Result

[TM 표적 약물 스크리닝 파이프라인 개발]

2D 형태 측정 파이프라인:

• 환자 유래 원발성 교모세포종 줄기세포(GBSC)의 2D 배양 조건(2DTM assay)에서 TM 형성 및 세포 간 Ca2+ communication을 확인 하였다.

• ilastik 오픈소스 소프트웨어를 활용하여 TM 및 세포체의 형태학적 파라미터(TM 길이, 세포당 TM 수)를 정량화하는 머신러닝 기반 알고리즘을 개발 하였다.

• Latrunculin B (TM 억제제) 및 ROCKi (TM 촉진제)를 사용하여 파이프라인의 정확성과 유효성을 검증하였다.

3D 형태 측정 파이프라인:

• 인간 뇌 구형체(hGliCS) 모델 및 생체 내 마우스 모델과 같은 복잡한 3D 환경에서 GBSC의 TM을 분석하기 위해 AIVIA 소프트웨어(머신러닝 지원 상업용 솔루션)를 사용하여 검증하였다.

• AIVIA는 3D 데이터 처리 및 품질 변화에 대한 강점으로 선택되었으며, TM 네트워크의 숫자, 길이, 세포체 수를 측정하는 3D 트래커 및 객체 정량화 도구를 사용하였다.

• 생체 내 마우스 모델에서 종양 침윤 영역과 종양 중심부 간의 TM 분포 차이를 분석하여 유효성을 확인하였다.

[PKC 조절제의 식별 및 항종양 효과]

• 약물 스크리닝 결과: 71가지 화합물 스크리닝 결과, PKC 조절제(TPPB, PMA)가 세포독성 없이 TM 형성 및 네트워크 기능을 강력하게 억제하는 것으로 확인되었다.

• TM 및 네트워크 기능 억제: TPPB와 PMA는 GBSC에서 TM 수와 길이 모두를 감소시켰고, 이는 추가적인 일차 교모세포종 세포주에서도 일관되게 관찰되었다. 두 약물 모두 TM 의존적인 종양 세포 네트워크의 Ca2+ 활동을 강력하게 감소시켰으며, 특히 종양 성장 촉진에 중요한 박동기(pacemaker) 유사 세포의 자율적 리듬 활동을 완전히 억제하였다.

• 3D 모델에서의 효과: TPPB는 hGliCS 모델에서 TM 네트워크를 파괴하고 종양 성장을 현저히 억제했으며, 종양 세포 면적 및 증식을 감소시켰다.

[분자 메커니즘: TTYH1 조절]

• Bulk RNA 시퀀싱 분석: TPPB와 PMA 처리 후 세 가지 GBSC에서 공통적으로 차등 발현된 유전자(DEG) 156개가 확인되었다.

• 유전자 기능 분석: DEG는 이동, 침윤 및 신경 발달과 관련된 용어에서 가장 풍부하게 나타나 TM 관련 기능이 주요 영향을 받는 생물학적 경로임을 확인하였다.

• TTYH1 하향 조절: TM 형성의 핵심 동인으로 알려진 TTYH1이 가장 현저하게 하향 조절된 유전자 중 하나로 확인되었다. 이는 모든 세포주에서 TPPB 및 PMA에 의해 영향을 받았음을 의미한다.

• 환자 유래 종양 오가노이드(tumoroids)에서의 검증: 환자 유래 종양 오가노이드에서 TPPB/RT 병용 치료는 TM 파괴 및 항종양 효과와 함께 TTYH1 단백질의 하향 조절을 동반하였다.

• TTYH1의 중요성: TTYH1은 신경 돌기 형성 및 침윤성 TM의 de novo 확장과 교모세포종 세포 증식에 중요하며, 생체 내 모델에서 종양 침윤 영역에서 특히 증가하였다.

• TPPB/RT 치료 후 침윤 영역과 종양 중심부 모두에서 GBSC 세포체에 국소화된 TTYH1 RNA 점이 감소하였다.

[결론 및 향후 전망]

• PKC 활성제(예: TPPB)는 TM 형성 및 네트워크 기능, 종양 세포 증식, 방사선 치료 저항성과 같은 교모세포종의 핵심 병리 생물학적 과정을 효과적으로 억제할 수 있다.

• 이는 부분적으로 TTYH1 조절을 통해 진행된다.

• 새롭게 개발된 2D 및 3D 형태 측정 파이프라인은 TM 표적 약물 개발을 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 도구를 제공한다.

• 교모세포종 네트워크의 약물에 의한 단절은 세포독성 치료에 대한 종양 세포의 취약성을 증가시킬 수 있다.

• PKC와 시간 경과에 따른 항종양 효과의 가변성은 향후 TM 표적 치료법을 정교화하기 위한 추가 연구의 필요성을 의미한다.

Figure 2: Identification of compounds with selective anti-TM effects