Boosting the Discovery of Small Molecule Inhibitors of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for the Treatment of Cancer, Infectious Diseases, and Inflammation

Ana Koperniku*, Adriana A. Garcia, and Daria Mochly-Rosen

Journal of Medicinal Chemistry  2022, 65, 6, 4403-4423

초록

We present an overview of small molecule glucose6-phosphate dehydrogenase (G6PD) inhibitors that have potential for use in the treatment of cancer, infectious diseases, and

inflammation. Both steroidal and nonsteroidal inhibitors have been identified with steroidal inhibitors lacking target selectivity. The main scaffolds encountered in nonsteroidal inhibitors are quinazolinones and benzothiazinones/benzothiazepinones. Three molecules show promise for development as antiparasitic (25 and 29) and anti-inflammatory (32) agents. Regarding modality of inhibition (MOI), steroidal inhibitors have been shown to be uncompetitive and reversible. Nonsteroidal small molecules have exhibited all types of MOI. Strategies to boost the discovery of small molecule G6PD inhibitors include exploration of structure− activity relationships (SARs) for established inhibitors, employment of high-throughput screening (HTS), and fragment-based drug discovery (FBDD) for the identification of new hits. We discuss the challenges and gaps associated with drug discovery efforts of G6PD inhibitors from in silico, in vitro, and in cellulo to in vivo studies.

한글초록

이 논문에서는 암, 감염질환 및 염증의 치료에 사용될 가능성이 있는 소분자 글루코스-6-인산 탈수소효소(G6PD) 억제제들을 제시한다. 스테로이드계와 비스테로이드계 억제제가 모두 확인되었으며, 스테로이드계 억제제는 표적 선택성이 부족하다. 비스테로이드계 억제제에서 주로 발견되는 핵심 골격(scaffold)은 quinazolinone과 benzothiazinone/benzothiazepinone 계열이다. 세 가지 분자(25와 29는 항기생충제, 32는 항염증제)가 개발 후보로서 가능성을 보인다. 억제 방식(MOI, mode of inhibition)과 관련하여, 스테로이드계 억제제는 비경쟁적(uncompetitive)이며 가역적(reversible) 억제를 나타내는 것으로 보고되었다. 비스테로이드 소분자는 모든 유형의 억제 방식을 나타냈다. 소분자 G6PD 억제제 발견을 촉진하기 위한 전략으로는 기존 억제제의 구조-활성 상관관계(SAR) 탐색, 고속 대량 스크리닝(HTS)의 활용, 그리고 새로운 히트 화합물 발굴을 위한 프래그먼트 기반 약물설계(FBDD)가 포함된다.  또한 논문에서는 in silico, in vitro, 세포(in cellulo) 및 in vivo 연구 단계에 걸쳐 G6PD 억제제 신약개발에서 나타나는 문제에 관해 논의한다.

1.    Introduction

-       세포는 생존을 위해 산화-환원 균형을 유지해야하고, 그 중심에는 NADPH가 존재함. NADPH의 주요 공급원이 Pentose phosphate pathway 이며 그 시작효소가 G6PD임.

-       PPP는 ROS제거, DNA/RNA 합성 전구체 생성, 지방산 합성 지원 역할을 하며 단순 대사 효소가 아니라 세포 증식과 산화 스트레스를 조절하는 핵심 조절자라 할 수 있음.

-       부족한경우: 용혈성 빈혈, 신경손상 / 과활성: 암, 염증, 감염 유도

-       즉, 질병 상황에 따라 활성/억제가 모두 치료 전략이 될 수 있는 타겟이 될 수 있음.

2.    생물학적 기능

1)    항산화 억제: G6PD가 만드는 NADPH는 Glutathione을 환원형으로 유지함. 산화 스트레스의 방어 스위치로서의 역할

2)    세포 증식의 조절: PPP는 ribose-5-phosphate를 생성하여 nucleotide 합성에 사용됨. 종양세포와 같은 빠르게 분열하는 세포는 G6PD의존성 높음

3.    G6PD 효소 구조와 결합 포인트

-       G6PD는 일반적인 dehydrogenase와 달리 NADP+binding site가 2개 존재함.

(1) Catalytic NADP site :→ 실제 반응 (G6P → 6-phosphogluconolactone) 진행

(2) Structural NADP site: → 효소 안정화 (dimer/tetramer 유지) 이러한 특성이 약물 설계를 어렵게 함.

-       Catalytic site 억제: 효소 활성의 억제, structural site: 효소 unfolding

-       즉 inhibitor가 enzyme inhibitor와 protein destabilizer가 동시에 되버릴 수 있음.

4.    Steroidal inhibitor (최초의 G6PD inhibitor)

Ex) DHEA, epidandrosterone

스테로이드에서 C3, C17 위치의 H-bond donor/acceptor 조합이 potency 를 결정함. OH 위치를 바꾸면 활성이 사라질 수 있고, cardonyl 을 바꾸면 species selectivity 가 변함. G6PD는 steroid-binding pocket이 있는 것이 아니라 NADP pocket 근처 hydrophobic cavity 에 끼어드는 방식이기 때문임. 결국 potency 보다는 androgen receptor off-target effect로 약물이 되지 못함.

5.    Non-steroidal inhibitor

1)    Quinazolinone : HTS에서 나온 최초의 hit scaffold이고 enzyme IC50은 좋으나 cell activity 약한 편, 이유는 polarity & permeability 문제. 세포내 농도 부족으로 cellular activity 가 나오지 않음

2)    P-aminophenol: p-aminophenol → 산화 → quinone-imine 생성 → thiol(GSH, cysteine)과 반응

실제 작용은 G6PD inhibition (X), 단백질 thiol alkylation

3)    Michael acceptor: 많은 G6PD inhibitor 가 electrophile, Michael acceptor를 가지고 있는데 세포 안에서 GSH와 반응하여 ROS를 생성함. 그래서 세포 죽음이 G6PD때문인지, ROS 때문인지 구분이 어려움. 즉: targeted inhibitor가 아니라 cytotoxic electrophile일 가능성

6.    Assay artifact

-       G6PD assay 는 일반적으로 NADPH 생성-> 340nm 흡광도 측정. 문제는 redox active compound들이 NADPH직접산화, buffer내 산화/환원 반응을 일으켜 false positive inhibitor로 작용함.

-       높은 농도의 DTT, TCEP 등 환원제를 쓰는 assay는 redox-cycler false positive를 만들 수 있으며, 반대로 고극성 화합물은 세포 투과성 부족으로 false negative가 되기 쉬움.

7.    Fragment based drug discovery 제안

-       이 논문에서는 FBDD를 통해 접근하는 것이 일반적인 접근 방법보다 inhibitor 개발에 유리할 것으로 예측함.

-       6‑aminonicotinamide(6AN, 40)는 저분자 NAD(P)⁺ analogue로 여러 dehydrogenase의 competitive inhibitor이지만 G6PD 특이성이 낮아 이런 fragment를 출발점으로 적용하면 효소 선택성이 증가할 것으로 예측

8.    G6PD inhibitor 개발이 어려운 이유

1)    RBC 독성 (on-target toxicity)

2)    redox-active false positives

3)    permeability 문제

4)    conserved binding site