Specific targeting of brain endothelial cells using enhancer AAV vectors

Velazquez-Rivera E, Dey O, Kim NS, Cao W, Ye Q, Gao P, Thai A, Nguyen JK, Zhang H, Ting JT, Gopi M, Ren B, Holmes TC, Xu X. Neuron. 2025 May 21;113(10):1562-1578.e6.

 doi: 10.1016/j.neuron.2025.03.031. PMID: 40403707; PMCID: PMC12117388.

Schematic workflow for the design of the BEC-enhancer AAV vectors. A. CATlas에서 뇌 혈관내피세포의 후보 조절 요소(BEC cCRE89763)를 찾아, 해당 강화인자 서열을 AAV 벡터에 넣어 바이러스 제작. 이 바이러스를 마우스에 주사한 후 4주간 체내에서 증식시켜 뇌 조직 분석 진행. B. 마우스 유전체 내 BEC 강화인자 서열과 쥐, 인간, 일부 비인간 영장류 유전체와의 비교. 박스 음영은 뉴클레오타이드 보존 정도를 나타내며, 더 짙은 음영일수록 보존도가 높음.

[Abstract]

Brain endothelial cells (BECs) in brain vasculature are critical structural and functional components of the blood brain barrier (BBB). Adeno-associated virus (AAV) capsids have previously been genetically engineered to confer specificity to endothelial cells, but these capsids show limited endothelial cell specificity that varies by delivery conditions. We developed a set of new BEC-enhancer AAV vectors that specifically target BECs based on the cis-regulatory elements identified from single-cell epigenetic datasets. Ex vivo and in vivo characterization of BEC-enhancer AAVs in wild-type, Ai9 reporter, and Alzheimer's disease model mouse brains show their utility for high transduction selectivity of the BECs with little off-target transduction in the liver. Our BEC-enhancer AAVs target the brain vasculature by systemic administration and can be minimally invasive in terms of the route of administration. They are useful new tools for delivering genetic payloads specifically to BECs for normal and diseased brain studies.

[한글 초록 요약]

뇌혈관의 뇌 내피세포(BECs)는 혈액-뇌 장벽(BBB)의 구조적·기능적 핵심 요소이다. 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드는 이전에 내피세포 특이성을 부여하도록 유전적으로 설계된 바 있으나, 이러한 캡시드는 투여 조건에 따라 내피세포 특이성이 제한적이고 변동성이 있다. 연구진은 단일세포 후성유전체 데이터셋에서 확인된 시스 조절 요소(cis-regulatory elements)를 기반으로, BEC에 특이적으로 작용하는 새로운 BEC-인핸서 AAV 벡터들을 개발하였다. 정상 생쥐, Ai9 리포터 생쥐, 그리고 알츠하이머병 모델 생쥐의 뇌에서 수행한 ex vivo 및 in vivo 특성 분석 결과, BEC-인핸서 AAV는 높은 BEC 선택적 전이(transduction) 능력을 보였으며, 간(liver)에서는 거의 전이되지 않아 비표적(transduction) 효과가 매우 적었다. 연구진이 개발한 BEC-인핸서 AAV는 전신 투여를 통해 뇌혈관을 표적화할 수 있으며, 투여 경로 측면에서 최소 침습적일 수 있다. 이 벡터들은 정상 및 질병 상태의 뇌 연구에서 BEC에 유전적 물질을 특이적으로 전달하는 데 유용한 새로운 도구이다.

[한글 논문 요약]

본 연구에서는 뇌 혈관 내피세포(BEC)를 특이적으로 표지하는 새로운 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 세트를 개발하고, 다양한 생체 내 실험을 통해 그 특이성, 효율성 및 안정성을 평가하였다. 단일세포 ATAC-seq 기반의 Cis-element Atlas (CATlas) 데이터베이스에서 EC 특이적 cCRE 후보 5개를 선별하였으며, 그중 cCRE89763 서열을 중심으로 분석을 진행하였다.

SYFP2 형광 단백질을 발현하는 BEC-enhancer AAV (AAV-PHP.eB-cCRE89763-minBG-SYFP2)를 생쥐에 레트로오비탈 주입한 결과, 뇌 전반의 혈액뇌장벽(BBB) 관련 미세혈관 구조를 특이적으로 표지하였으며, 평균 혈관 직경은 8.66μm로 측정되었다. Tie2-Cre; Ai9 유전적 EC 표지 마우스 및 CD31 면역염색과의 비교에서 높은 일치도(Dice: 0.64 ± 0.03)를 보였고, 라이트시트 현미경 이미징에서는 Dice 0.76 ± 0.02로 더욱 향상된 유사도를 확인하였다.

캡시드 종류에 따른 표지 특이성 차이를 분석한 결과, AAV-BR1 캡시드에서도 EC 특이적 표지가 유지되었으나 Dice 지수(0.47 ± 0.05)는 PHP.eB보다 다소 낮았다. 또한, BEC-enhancer AAV는 생체 내 2광자 현미경 영상에서 혈관 구조에 정확히 대응하는 표지 신호를 보였으며, 고령 마우스에서도 안정적인 표지가 가능함을 확인하였다.

투여 경로별 분석에서는 레트로오비탈 주입이 가장 높은 EC 특이성을 보였고, 뇌내 주입은 신경세포 및 아교세포의 비특이적 표지를 유도하였다. 반면, 뇌실내 주입(i.c.v.)에서는 일부 EC 표지가 가능하였다.

SYFP2 대신 Cre 재조합효소(iCre)를 발현하는 벡터로 개조한 결과, 용량에 따라 EC 특이성을 조절할 수 있었으며, neuron-specific miRNA 타겟 서열(4×6T) 및 iCre(R279T) 변이체를 도입해 신경세포 비특이적 표지를 효과적으로 억제할 수 있었다. 간 등 비표적 조직에서의 발현도 낮게 유지되었으며, 알츠하이머 모델(5×FAD)에서도 병리 영역에 선택적으로 EC 표지를 유도하였다.

Discussion

본 연구에서는 마우스 뇌 혈관 내피세포(EC)를 높은 특이성으로 표지하는 새로운 AAV 기반 바이러스 벡터 세트를 개발하였다. BEC enhancer는 내피세포 표적 AAV 캡시드의 세포 특이적 표지 능력을 향상시키며, 노화된 알츠하이머병(AD) 마우스 모델에서도 내피세포를 지속적으로 표적화하는 능력을 보여, 질병 연구 및 치료 가능성을 시사한다. 본 결과는 BEC-enhancer AAV가 뇌 연구뿐 아니라 신경학적 뇌 질환에 대한 내피세포 지향 유전자 치료 도구로 발전할 가능성을 보여준다.

최근 5년간 AAV 변형체 개발이 급증했으며, 주로 캡시드 엔지니어링(합리적 설계, 직접 진화, 인실리코 방법)을 통해 세포 특이성이 크게 향상되었다. AAV-PHP.eB 캡시드는 BBB를 통과해 뇌 전역에 유전물질을 전달할 수 있으며, 다양한 프로모터 및 인핸서를 통해 특정 뇌 세포를 표적화하는 데 활용되고 있다. 그러나 적절한 프로모터 선택 역시 중요하며, CAG 프로모터는 널리 사용되나 내피세포에서는 효율이 낮아 BEC enhancer의 도입이 필요함을 본 연구가 확인하였다.

또한, 바이러스 투여 경로는 표지 특이성에 큰 영향을 미치며, 정맥주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사에 따라 차이가 관찰되었다. 바이러스 캡시드 종류, 운반체(cargo) 및 투여 용량도 특이성에 영향을 준다. 예를 들어, SYFP2를 운반할 때와 Cre 재조합효소를 운반할 때 표지 특이성과 민감도가 다르게 나타났다. 이를 개선하기 위해 감쇠형 Cre 변이체 및 neuron-specific miRNA 타겟 4×6T 카세트를 도입해 신경세포 비표적 표지를 효과적으로 억제하였다.

다른 캡시드인 AAV-BR1과 결합했을 때도 BEC enhancer는 표적 특이성을 향상시켰으며, 이는 BEC enhancer가 특정 캡시드에 종속되지 않고 효과가 있음을 시사한다. 뇌 내 기능적 혈관에서도 광범위한 내피세포 표지는 신경퇴행성 질환에서 미세혈관 네트워크를 통한 치료제 전달에 매우 중요하다.

특히 AD 마우스 모델에서 BEC-enhancer AAV가 병리 영역의 내피세포를 효과적으로 표지하는 점은, 내피세포가 AD에 영향을 받는다는 점과 나이가 들면서 AAV 전달 효율이 감소한다는 점을 고려할 때, 노화 관련 뇌 질환 치료 적용 가능성을 확장한다. 또한, 해당 인핸서 서열은 인간과 일부 영장류에서도 보존되어 있어 종간 적용 가능성도 기대된다.

마지막으로, 단일세포 유전체학 및 후성유전체 기술 발전에 힘입어 새로운 인핸서 발굴이 가능해졌으며, CATlas, ENCODE 등의 데이터베이스를 활용한 캡시드 엔지니어링과 게놈 설계의 결합은 특정 세포 표적화와 비표적 발현 감소에 매우 효과적이다. 연구진은 BEC-enhancer AAV를 연구자들에게 널리 제공하여, 질병 상태에서 발현이 저하된 유전자 전달 및 내피세포 활성 조절 도구로 활용될 수 있도록 하는 것을 목표로 한다.