Virtual Screening Directly Identifies New Fragment-Sized Inhibitorsof Carboxylesterase Notum with Nanomolar Activity

논문 제목 Virtual Screening Directly Identifies New Fragment-Sized Inhibitors of Carboxylesterase Notum with Nanomolar Activity

저자명 David Steadman, Benjamin N. Atkinson, Yuguang Zhao, Nicky J. Willis, Sarah Frew, Amy

Monaghan, Chandni Patel, Emma Armstrong, Kathryn Costelloe, Lorenza Magno, Magda

Bictash, E. Yvonne Jones, Paul V. Fish,* and Fredrik Svensson

Publish 2022 Jan 13

DOI https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c01735

Abstract

Notum is a negative regulator of Wnt signaling acting through the hydrolysis of a palmitoleoylateester, which is required for Wnt activity. Inhibitors of Notum could be of use in diseases where dysfunctional Notum activity is an underlying cause. A docking-based virtual screen (VS) of alarge commercial library was used to shortlist 952 compounds for experimental validation as inhibitors of Notum. The VS was successful with 31 compounds having an IC50 < 500 nM. Acritical selection process was then applied with two clusters and two singletons (1−4d) selected for hit validation. Optimization of 4d guided by structural biology identified potent inhibitors of Notum activity that restored Wnt/β-catenin signaling in cell-based models. The[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyradizin-3(2H)-one series 4 represent a new chemical class of Notum inhibitors and the first to be discovered by a VS campaign. These results demonstrate the value of VS with well-designed docking models based on X-ray structures.

한글 초록 요약본

Notum은 Wnt 활성에 필수적인 팔미톨레오일산 에스터(palmitoleoylate ester)를

가수분해함으로써 Wnt 신호 전달을 음성 조절하는 단백질임. Notum의 기능 이상이 질병의 근본

원인인 경우, Notum 저해제는 치료적으로 활용 가능함. 대규모 상업용 화합물 라이브러리를

대상으로 도킹 기반 가상 스크리닝(Virtual Screening, VS)을 수행하여, Notum 저해제로서

실험적 검증 대상 화합물 952종을 선별함. 해당 VS 결과, IC₅₀ 값이 500 nM 미만인 화합물

31종이 확인되어 높은 성공률을 보였음. 이후 엄격한 선별 과정을 통해 두 개의 클러스터와 두

개의 단독 화합물(singleton) (1–4d)을 hit 검증 대상으로 선정함. 구조생물학적 정보를 기반으로

4d 화합물의 최적화를 수행한 결과, 세포 기반 모델에서 Wnt/β-catenin 신호 전달을 회복시키는

강력한 Notum 저해제를 도출함. [1,2,4]triazolo[4,3-b]pyradizin-3(2H)-one 계열 화합물 4는

새로운 화학적 계열의 Notum 저해제이며, 가상 스크리닝 캠페인을 통해 최초로 발견된 사례임.

본 연구 결과는 X-ray 구조를 기반으로 정교하게 설계된 도킹 모델을 활용한 가상 스크리닝의

유효성을 입증함.

한글 논문 요약본

1. Introduction

Notum은 분비형 carboxylesterase로서, Wnt 단백질에 결합된 palmitoleoyl ester를 가수분해하여

Wnt 신호를 비활성화하는 음성 조절자(negative regulator) 임. Notum의 과도한 활성은 Wnt

signaling 감소와 연관되며, 이는 골다공증, 퇴행성 질환, 특정 암 등 다양한 질환과 연결될 수

있음. 이러한 이유로 Notum은 Wnt signaling을 회복시키기 위한 유망한 약물 타깃으로 주목받고

있음. 기존의 Notum 억제제 연구는 주로 phenotypic screening 또는 제한적인 hit-to-lead 접근에

의존해 왔으며, virtual screening(VS) 만으로 새로운 화학 골격(scaffold)을 직접 발굴한 사례는

드물었음. 특히 fragment-sized, 물성적으로 단순하면서도 강력한 억제제를 VS만으로 찾아낼 수

있는지에 대해서는 실증적 근거가 부족한 상황이었음. 본 연구는 대규모 structure-based virtual

screening을 통해 새로운 fragment-sized Notum 억제제를 발굴하고, 이를

생화학적·구조생물학적·세포 기반 실험으로 검증함으로써, VS 기반 hit discovery의 실질적

효용성을 입증하는 것을 목표로 함.

2. Methods

2.1 Virtual Screening 전략

본 연구에서는 ChemDiv 상업 라이브러리에 포함된 약 150만 개 화합물을 출발점으로 설정함. 이

중 물성 기반 필터링을 통해 분자량(MW), logD, TPSA, 수소 결합 공여체/수용체 수, 회전 결합 수

등을 기준으로 fragment/lead-like 특성을 갖는 화합물 534,804개를 선별함.

선별된 화합물은 Notum의 활성 부위 구조를 기반으로 Glide docking을 이용한 structure-

based virtual screening을 수행함. 도킹 점수 기준 상위 화합물 중 Glide score ≤ −9를

만족하는 1330개를 1차 hit 후보로 선정함. 이후 수동 검토(manual inspection)를 통해 결합

포즈의 합리성, 반응성 그룹 존재 여부, 합성 가능성 등을 고려하여 1088개를 구매 대상으로

결정하였고, 실제 확보 가능한 952개 화합물을 실험에 사용함.

2.2 생화학적 Assay

Notum 효소 활성 평가는 OPTS (p-nitrophenyl ester 유사 기질) 를 이용한 fluorogenic assay로

수행함. 1 μM 농도에서 50% 이상 효소 활성을 억제하는 화합물을 1차 hit으로 정의하였고, 이후 농도–반응 곡선을 통해 IC₅₀ 값을 산출함.

2.3 구조생물학 및 세포 실험

X-ray crystallography를 통해 Notum–억제제 복합체 구조를 결정하여 실제 결합 모드를 검증함.

세포 기반에서는 TCF/LEF luciferase reporter assay를 이용하여 Notum 존재 하에서 억제제가

Wnt/β-catenin signaling을 회복시키는지를 평가함. 일부 화합물에 대해서는 in vitro ADME 및

마우스 PK 실험을 통해 체내 노출과 BBB 투과성을 평가함.

3. Results

3.1 Virtual Screening 결과 및 Hit 도출

952개 화합물에 대한 생화학적 스크리닝 결과,

- 1 μM에서 50% 이상 억제: 44개 (hit rate 4.6%)

- IC₅₀ < 500 nM: 31개 (hit rate 3.2%)

의 비교적 높은 hit rate를 보였음. 이는 VS 기반 접근이 Notum과 같은 효소 타깃에 대해 충분한

탐색 효율을 가질 수 있음을 시사함.

3.2 Hit 시리즈 분류 및 평가

31개 hit은 구조적 특성에 따라 두 개의 클러스터와 두 개의 singleton으로 분류됨.

- Oxazolone 계열(Cluster 1): 높은 효소 억제 활성을 보였으나 용해도 및 세포 적용성

문제로 최적화 중단.

- Thiadiazolotriazinone 계열(Cluster 2): 재합성 시 활성 재현성이 낮고 물성 문제가

관찰됨.

- Singleton 3: Notum의 촉매 Ser232와 공유결합을 형성하는 covalent inhibitor로 확인됨.

- Singleton 4d: fragment-sized임에도 불구하고 IC₅₀ 27 nM의 강력한 활성을 보이며,

물성적으로도 우수하여 핵심 lead 시리즈로 선정됨.

3.3 Triazolopyradizinone (4) 시리즈 최적화

4d를 출발점으로 한 [1,2,4]triazolo[4,3-b]pyradizin-3(2H)-one 시리즈는 구조 변형을 통해 다수의

유도체가 합성되었으며, 일부 화합물은 IC₅₀ < 10 nM의 활성을 나타냄.

X-ray 구조 분석 결과, 이 시리즈는

- carbonyl 산소가 oxyanion hole을 점유하고

- 방향족 치환기가 Notum의 hydrophobic pocket을 깊게 채우는 결합 모드를 가짐으로써

강력한 효소 억제 활성을 설명할 수 있었음.

4. Discussion

본 연구의 가장 큰 의의는 대규모 도킹 기반 virtual screening만으로도 새로운 Notum 억제제

화학 골격을 직접 발굴할 수 있음을 실증적으로 입증했다는 점임. 특히 hit들이 대부분 fragment-

sized임에도 불구하고 나노몰 수준의 활성을 보였다는 점은, Notum 활성 부위가 비교적

druggable하며 구조 기반 설계에 적합함을 시사함.

다만, 대표 화합물 4d의 경우 in vitro permeability는 양호했음에도 불구하고 마우스 뇌 농도가

LLOQ 이하로 측정되어 BBB 투과성에는 한계가 있음이 확인됨. 저자들은 이는 P-gp 외의 efflux

transporter 또는 약산성 특성에 기인할 가능성을 제시하며, CNS 타깃보다는 말초(peripheral)

질환에서의 활용 가능성을 논의함.

5. Conclusion

본 연구는 structure-based virtual screening을 통해 새로운 fragment-sized Notum 억제제를 직접

발굴하고, 이를 구조생물학적·세포 기능적 수준까지 검증한 성공적인 사례임. 특히

triazolopyradizinone 시리즈는 기존에 보고되지 않은 신규 Notum 억제제 클래스로, 향후 Wnt

signaling 관련 질환 연구에서 중요한 chemical tool로 활용될 수 있음.

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