Repositioning of Small Molecules through the Inverse Virtual Screening in silico Tool: Case of Benzothiazole-Based Inhibitors of Soluble Epoxide Hydrolase (sEH)

Erica Gazzillo, Ester Colarusso, Assunta Giordano, Maria Giovanna Chini, Marianna Potenza, Robert Klaus Hofstetter, Maria Iorizzi, Oliver Werz, Gianluigi Lauro, and Giuseppe Bifulco

https://doi.org/10.1002/cplu.202400234 ChemPlusChem 89(9):e202400234

Abstract (영문)

Computational techniques accelerate drug discovery by identifying bioactive compounds for specific targets, optimizing molecules with moderate activity, or facilitating the repositioning of inactive items onto new targets. Among them, the Inverse Virtual Screening (IVS) approach is aimed at the evaluation of one or a small set of molecules against a panel of targets for addressing target identification. In this work, a focused library of benzothiazole-based compounds was re-investigated by IVS. Four items, originally synthesized and tested on bromodomain-containing protein 9 (BRD9) but yielding poor binding, were critically re-analyzed, disclosing only a partial fit with 3D structure-based pharmacophore models, which, in the meanwhile, were developed for this target. Afterwards, these compounds were re-evaluated through IVS on a panel of proteins involved in inflammation and cancer, identifying soluble epoxide hydrolase (sEH) as a putative interacting target. Three items were subsequently confirmed as able to interfere with sEH activity, leading to inhibition percentages spanning from 70 % up to 30 % when tested at 10 μM. Finally, one benzothiazole-based compound emerged as the most promising inhibitor featuring an IC50 in the low micromolar range (IC50=6.62±0.13 μM). Our data confirm IVS as a predictive tool for accelerating the target identification and repositioning processes.

한글초록요약

계산 기반 기법은 특정 표적에 대한 생리활성 화합물의 발굴, 중간 수준의 활성을 가진 분자의 최적화, 혹은 활성이 없던 화합물을 새로운 표적에 재배치하는 과정을 통해 신약 개발을 가속화한다. 이 중 Inverse Virtual Screening(IVS, 역방향 가상 스크리닝) 접근법은 표적 식별을 목적으로, 하나 또는 소수의 분자에 대해 다양한 표적군에 대한 평가를 수행하는 데 중점을 둔다.

본 연구에서는 benzothiazole(벤조티아졸) 기반 화합물로 구성된 포커스 라이브러리를 IVS를 통해 재조사하였다. 원래는 bromodomain-containing protein 9 (BRD9)에 대해 합성 및 시험되었으나 결합력이 낮았던 네 개의 화합물들이 선택되었고, 이후 이 화합물들은 해당 표적을 위해 개발된 3차원 구조 기반 약물유사성 모델과의 부분적인 적합성만을 보여주었다.

이에 따라 이 화합물들은 염증 및 암에 관여하는 다양한 단백질 패널에 대해 IVS를 통해 재평가되었고, 그 결과 soluble epoxide hydrolase (sEH)를 잠재적인 상호작용 표적으로 확인할 수 있었다. 이 중 세 개 화합물은 실제로 sEH 활성을 방해하는 것으로 확인되었으며, 10 μM 농도에서 70 %에서 30 % 사이의 저해율을 나타냈다. 최종적으로 한 개의 benzothiazole 기반 화합물이 가장 유망한 저해제로 나타났으며, 낮은 마이크로몰 수준의 IC50(IC50=6.62±0.13 μM)을 보였다.

이러한 결과는 IVS가 표적 식별 및 약물 재배치 과정을 가속화하는 예측 도구로서의 가능성을 입증함을 보여준다.

한글 논문 요약

1. Introduction

계산 기반 기법(computational methods)은 신약 후보 물질의 발굴 및 재배치에 매우 유용함.

IVS는 하나 혹은 소수의 화합물에 대해 다수의 표적(targets)을 대상으로 스크리닝하여 표적식별 또는 재배치에 활용됨. 본 연구는 BRD9 억제를 목적으로 합성된 benzothiazole 기반 화합물(3–6)이 실패한 원인을 분석하고, IVS를 활용하여 새로운 작용 표적을 규명하며, 생화학적 실험을 통해 실제 억제 활성을 검증하는 것을 목표로 함.

2. Methods

2-1. Ligand Library 설계

- BRD9 억제제인 I-BRD9의 구조를 shape query로 설정하여 shape similarity 기반으로 benzothiazole scaffold 선정 (Shape Sim = 0.78).

- CombiGlide를 사용하여 총 255만 개의 조합 화합물 생성.

- 약물 유사성(Lipinski Rule)을 기반으로 필터링 후 324,676개를 도킹 대상 후보로 선정.

2-2. 합성(Synthesis)

- 4개 화합물(3–6)을 Suzuki-Miyaura 반응 및 아실화/설폰화 반응으로 합성 (각 화합물은 HPLC로 95% 이상 순도로 정제됨).

2-3. IVS 및 도킹

- Autodock Vina를 이용해 335개의 암 및 염증 관련 단백질에 대해 도킹 수행.

- 도킹 스코어를 기준으로 binding affinity를 정규화(normalization)하여 타겟 예측 정확도 향상.

2-4. 실험적 검증

- BRD9에 대한 AlphaScreen binding assay 수행.

- sEH에 대한 in vitro 효소 억제 실험과 세포 독성 실험(human monocytes) 진행.

3. Results

3-1. BRD9에 대한 low activity 원인 분석

- 3D pharmacophore 모델과의 적합도 부족.

- 특히 acetyl-lysine mimic 기능 결여로 인해 BRD9의 주요 수소결합 자리(Asn100 등)와 결합 실패.

3-2. IVS 결과

- 335개 표적 중, soluble epoxide hydrolase (sEH)가 공통적으로 상위에 랭크됨.

- 각 화합물별 예측 타겟 순위: 4, 5, 6번 (1위), 3번 (4위)

3-3. sEH에 대한 생물학적 검증

- sEH 억제 활성을 확인 (5번 화합물이 가장 강한 억제제로 확인됨)

3-4. 결합 모드 분석

- 5번 화합물은 sEH의 Asp335, Tyr383, Tyr466와 수소결합 형성.

- Phe381, Trp336과 π–π 상호작용 통해 안정적 결합 구조 형성.

4. Conclusion

- BRD9 표적화에 실패한 화합물들을 IVS 접근을 통해 sEH 억제제로 성공적으로 재배치함.

- 5번 화합물은 새로운 sEH 억제제 후보로서, 항염증 치료에 잠재력을 보임.

- IVS는 비활성 또는 저활성 화합물의 생물학적 타겟 재탐색 및 다중 타겟 활성 예측에 유효한 전략임을 입증함.

Computational workflow applied