Loss of Rsph9 causes neonatal hydrocephalus with abnormal development of motile cilia in mice.
- 김소영
- 10월 22일
- 2분 분량
Wenzheng Zou, Yuqing Lv, Zux iang Liu, Pengyan Xia, Hong Li & Jianwei Jiao
Scientific reports, 24 July 2020
Abstract:
Hydrocephalus is a brain disorder triggered by cerebrospinal fluid accumulation in brain cavities. Even though cerebrospinal fluid flow is known to be driven by the orchestrated beating of the bundled motile cilia of ependymal cells, little is known about the mechanism of ciliary motility. RSPH9 is increasingly becoming recognized as a vital component of radial spokes in ciliary “9 + 2” ultrastructure organization. Here, we show that deletion of the Rsph9 gene leads to the development of hydrocephalus in the early postnatal period. However, the neurodevelopment and astrocyte development are normal in embryonic Rsph9−/− mice. The tubular structure of the central aqueduct was comparable in Rsph9−/− mice. Using high-speed video microscopy, we visualized lower beating amplitude and irregular rotation beating pattern of cilia bundles in Rsph9−/− mice compared with that of wild-type mice. And the centriolar patch size was significantly increased in Rsph9−/− cells. TEM results showed that deletion of Rsph9 causes little impact in ciliary axonemal organization but the Rsph9−/− cilia frequently had abnormal ectopic ciliary membrane inclusions. In addition, hydrocephalus in Rsph9−/− mice results in the development of astrogliosis, microgliosis and cerebrovascular abnormalities. Eventually, the ependymal cells sloughed off of the lateral wall. Our results collectively suggested that RSPH9 is essential for ciliary structure and motility of mouse ependymal cilia, and its deletion causes the pathogenesis of hydrocephalus.
한글 초록 요약본:
이 연구는 RSPH9 단백질이 뇌의 운동 섬모 (Motile cilia) 구조와 기능에 필수적이며 해당 유전자의 결손이 신생아 수두증을 유발한다는 것을 밝혔음. RSPH9은 섬모의 ‘9+2’ 미세소관 구조에서 radial spoke head 복합체의 구성 단백질로, 섬모의 조화된 운동을 조절함. 연구진은 Rsph9 유전자 결손 생쥐 (Rsph9-/-)를 CRISPR/Cas9으로 제작하여 이 마우스에서 운동섬모 운동 이상, 뇌실 내 뇌척수액 흐름 장애, 뇌실 확장 및 염증 반응이 동반된 수두증이 발생함을 확인함. 결과적으로 Rsph9 결손은 섬모의 비정상적 운동 패턴 (회전형 운동, 저진폭)을 초래하며 ependymal cell 손상과 glial activation, 혈관 이상 및 수초 손상으로 이어짐. 따라서 RSPH9은 섬모의 운동성과 뇌척수액 순환 유지에 필수적인 단백질임을 입증함.
한글 논문 요약본 (Intro, Methods, Results)
1) Introduction: 수두증은 뇌실 내 뇌척수액이 과도하게 축적되어 발생하는 선천성 신경질환임. CSF는 맥락총에서 생성되어 3,4 뇌실 및 중뇌수도관을 통해 흐르며, 섬모의 조화된 beating 운동이 그 흐름을 조절함. 운동섬모는 ‘9+2’형태의 축사 구조를 가지며 RSPH9은 radial spoke head에 위치한 구조 단백질임. 인간에서는 RSPH9 변이가 원발성 섬모운동장애를 일으키지만, 섬모 운동의 분자 기전은 여전히 불분명함. 본 연구는 마우스 Rsph9 유전자 결손 모델을 통해 RSPH9의 생리적 역할과 수두증 병태생리 기전을 규명하고자 함.
2) Methods
2-1) 마우스 제작: CRSPR-Cas9 시스템으로 Rsph9 exon1 부위에 8bp 결손을 유도하여 premature stop codon 형성; Rsph9+/- 마우스를 교배해 Rsph -/- 개체 획득
2-2) 면역염색: RSPH9, GFAP, IBA1, MBP, OLIG2, S100β 등 항체를 사용해 뇌 조직 염색.
2-3) 영상 분석:
-고속비디오 현미경으로 섬모 운동 패턴 분석 (380fps)
-MRI 및 Nissl 염색으로 뇌실 구조 평가
-Evans blue를 이용한 CSF 유동 추적
2-4) 전자현미경 (TEM): 섬모의 초미세 구조 및 축사 관찰
2-5) 데이터 분석: Student’s t-test, SEM 표기 방식으로 통계 검정 수행
3) Results
3-1) Rsph9 유전자 제거 및 표현형: Rsph-/- 마우스는 출생 후 성장 지연과 높은 사망률을 보였으며, 생존 개체는 구형의 두개골과 신경학적 이상 (무기력, 근력 저하)을 나타남.
3-2) 진행성 수두증 및 부비동염 발생: MRI에서 측뇌실 확장, 피질 얇아짐, 해마 및 시상압박이 관찰됨./ CSF는 맑고 출혈 없음 -> 폐쇄성 요인보다는 섬모 기능 장애로 인한 순환 장애로 판단됨.
3-3) 배아기 뇌 발달 이상은 없음: BrdU/EdU, CUX1, CTIP2, GFAP 염색 결과 배아기 신경발생, 신경이동, 성상세포 발달은 정상이므로 출생 후 결함에 의해 수두증 발현.
3-4) CSF 흐름 장애: Evans blue 주입 후, Rsph -/- 마우스에서 3,4 뇌실로 염료가 이동하지 않음. 수도관 형태는 정상이니 물리적 폐쇄가 아닌 운동섬모 기능 부전이 원인.
3-5) 섬모 운동 이상: Wild type은 규칙적인 평면 운동을 보이나 Rsph9-/-은 저진폭, 불규칙 회전형 운동을 보임. TEM상 대부분은 정상 ‘9+2’ 구조지만 일부 축사 불완전 및 비정상적 섬모막 내포 확인, Centriolar patch 면적 증가, 섬모 배열 불균형으로 운동 조정 장애 초래함.
3-6) 뇌 조직 병리 변화: GFAP, IBA1 증가; reactive astrogliosis, microgliosis 동반/ 혈관 밀도 및 분지 감소, MBP 감소/ OLIG2 증가; 수초 손상 및 재생 시도, Ependymal layer 손상 및 탈락 확인; 뇌실벽 파괴 진행.
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