AI-Powered Virtual Screening of Large Compound Libraries Leads to the Discovery of Novel Inhibitors of Sirtuin-1
- 임지현
- 11월 25일
- 4분 분량
Anastasiia Gryniukova, Florian Kaiser, Iryna Myziuk, Diana Alieksieieva, Christoph Leberecht, Peter P. Heym, Olga O. Tarkhanova, Yurii S. Moroz, Petro Borysko, V. Joachim Haupt
10.1021/acs.jmedchem.3c00128
Abstract
The discovery of new scaffolds and chemotypes via high-throughput screening is tedious and resource intensive. Yet, there are millions of small molecules commercially available, rendering comprehensive in vitro tests intractable. We show how smart algorithms reduce large screening collections to target-specific sets of just a few hundred small molecules, allowing for a much faster and more cost-effective hit discovery process. We showcase the application of this virtual screening strategy by preselecting 434 compounds for Sirtuin-1 inhibition from a library of 2.6 million compounds, corresponding to 0.02% of the original library. Multistage in vitro validation ultimately confirmed nine chemically novel inhibitors. When compared to a competitive benchmark study for Sirtuin-1, our method shows a 12-fold higher hit rate. The results demonstrate how AI-driven preselection from large screening libraries allows for a massive reduction in the number of small molecules to be tested in vitro while still retaining a large number of hits.
한글초록요약
고처리량 스크리닝을 통해 새로운 스캐폴드와 케모타입을 발견하는 과정은 번거롭고 많은 자원이 소모됨. 그러나 상업적으로 이용 가능한 소분자 화합물이 수백만 개에 달해, 이를 전부 in vitro로 검사하는 것은 현실적으로 불가능함. 본 연구에서는 스마트 알고리즘을 이용해 거대한 스크리닝 라이브러리를 표적 특이적인 수백 개 규모의 소분자 세트로 축소할 수 있음을 보였으며, 이를 통해 더 빠르고 비용 효율적인 hit 발굴이 가능함을 제시함. 이 가상 스크리닝 전략의 적용 사례로, 260만 개 화합물 라이브러리에서 Sirtuin-1 저해를 위해 434개 화합물을 사전 선별하였고, 이는 전체 라이브러리의 0.02%에 해당함. 이후 다단계 in vitro 검증을 통해 최종적으로 화학적으로 새로운 9종의 저해제를 확인함. 또한 Sirtuin-1에 대한 경쟁적 벤치마크 연구와 비교했을 때, 본 방법은 hit rate가 약 12배 더 높음을 보임. 이러한 결과는 AI 기반 사전 선별이 대규모 라이브러리에서 in vitro로 테스트해야 할 화합물 수를 대폭 줄이면서도 충분한 수의 hit를 유지할 수 있음을 입증함.
1. INTRODUCTION
- 최근 AI·컴퓨팅 발전으로 초거대 라이브러리를 대상으로 한 “brute-force” 도킹/MD 기반 가상스크리닝이 성공 사례를 내고 있으나, 이런 접근은 계산 자원과 시간이 매우 많이 들어 일반 연구팀이 쓰기 어렵다는 한계가 있음.
- 공급업체들이 BBB-permeable, kinase-focused 등 목적 지향적 소형 라이브러리를 제공하지만, 이런 세트는 이미 알려진 화학 모티프에 편중되기 쉬워 새로운 chemotype 발굴에 제약이 있음.
- 이를 해결하기 위해 저자들은 PharmAI DiscoveryEngine이라는 지식 기반 AI 가상스크리닝 플랫폼을 소개함. 타깃의 결합부위 특징과 상호작용 패턴 유사성을 활용해 “타깃-특이적 소수 후보 세트”를 생성하는 방식임.
2. RESULTS AND DISCUSSION
2-1. 전체 목표 및 워크플로우
- Enamine Screening Collection 2,633,036개 화합물 중에서 SIRT1 신규 억제제를 찾는 것이 목표임. in silico 기반의 후보 축소 → 다단계 in vitro 검증 → MD로 작용 기전 확인의 파이프라인을 설계함(그림 1).
2-2. In silico 후보 축소
- SIRT1의 결정구조(PDB 4ZZI, 4I5I)를 기반으로 DiscoveryEngine이 active site 특징과 결합 가능성 높은 scaffold를 찾아냄.
- 그 결과 260만 개에서 434개(0.02%)로 라이브러리를 축소한 후보 세트를 생성함.
2-3. 다단계 in vitro 검증
2-3-1. 1차 결합 검증(TSA)
- 434개 화합물을 thermal shift assay로 스크리닝하여 Tm shift가 유의한 14개 결합 hit를 선별함(표 1).
2-3-2. 선택성 검증(TSA counter-screen)
- 14개 hit를 비관련 단백질 carbonic anhydrase에 대해 TSA 재검증하여 비선택적 binder 5개를 제거함. 최종적으로 9개 hit가 농도 의존적 Tm 변화를 보였음(그림 2).
2-3-3. 기능 억제 검증(SIRT-Glo + counter-screens)
- 9개 hit에 대해 SIRT-Glo(루시퍼레이스 기반)로 효소 억제 효과를 확인하고, 8-point dose-response로 IC50을 산출함(그림 3).
- 루시퍼레이스 억제에 의한 위양성 제거를 위해 Kinase-Glo, protease 기반 검출계 간섭 제거를 위해 thrombin assay를 counter-screen으로 수행함. 9개 모두 SIRT1-특이적 억제임을 확인함(표 2).
- 7개 화합물은 low-µM IC50, 그중 compound (8)이 1.2 µM로 가장 강력했으며, 2개는 10~40 µM 수준의 중간 효능을 보였음.
2-3-4. Label-free 최종 검증(LC/MS)
- 9개 hit를 RapidFire LC/MS 기반 label-free 효소 반응으로 재검증함(그림 4). 억제율 30% 이상 기준에서 compound (5)가 유의 억제(약 42%), compound (1)도 경계선 수준의 억제를 보였음. 최종적으로 두 compound를 ‘reconfirmed inhibitor’로 제시함.
2-4. 작용 기전(MD 시뮬레이션 및 결합 모드)
- compound (1)을 대상으로 100 ns × 3회 MD를 수행하여 결합 안정성과 핵심 상호작용을 분석함.
- Ser265/Ile270 주변의 F···H-C polarized 접촉, Arg274·Val412와의 수소결합, Phe273/Phe297/His363와의 hydrophobic/π-stacking이 결합을 지지하는 주요 요인으로 제시됨(표 3, 그림 5).
2-5. Hit series 및 벤치마크 비교
- hit들은 인돌(1–5,9) 계열과 우레아(6,8) 계열 두 시리즈로 묶이며, amide coupling/urea formation으로 쉽게 유도체 확장이 가능해 최적화 출발점으로 적절하다고 논의함.
- Chiba et al. 콘테스트(총 3192개 실험→7개 hit, hit rate 0.22%) 대비, 본 연구는 434개만 실험해 9개 hit(2.1%)를 얻어 IC50 ≤10 µM 기준으로 12배 높은 hit rate를 달성함(그림 6).
3. CONCLUSIONS
- 대형 라이브러리 HTS는 assay 안정성, 높은 단백질 요구량, 소분자 소모 등 현실적 제약이 큼. AI 기반 타깃-특이적 후보 축소는 비용-성공비를 극적으로 개선하는 전략임.
- 260만 개를 434개로 줄인 뒤 다단계 검증을 통해 두 개의 강력하고 구조적으로 새로운 SIRT1 억제제와 추가 7개의 유망 리드를 확보했음을 강조함.
- MD 결과로 hydrophobic 상호작용과 보존된 수소결합 조합이 결합을 지배하며, analogue-by-catalog 및 후속 약물화에 좋은 출발점임을 제시함.
4. METHODS
4.1 Virtual screening (DiscoveryEngine 핵심 원리)
- PDB에 존재하는 결합부위를 지문(fingerprint)화하고, 타깃 결합부위와 유사한 binding pattern을 가지는 PDB 복합체들을 AI로 탐색함.
- PLIP으로 상호작용 프로파일을 비트벡터화하고, PDB 전체와 매칭해 primary scaffold를 찾은 뒤 최종 86개 scaffold/434개 hit를 산출함(PAINS <4%).
4.2 TSA(thermal shift assay)
- hSIRT1(1.3 µM)에 화합물 20 µM을 처리하고 Sypro Orange로 melting curve를 측정함. ΔTm이 plate 평균 대비 3SD 이상이면 hit로 판단함.
- 동일 조건에서 carbonic anhydrase에 대한 TSA로 비선택적 binder를 제거함
4.3 SIRT-Glo 기능 assay 및 counter-screens
- 0.5 nM SIRT1 조건에서 20 µM 단일 농도 스크리닝 후, 8-point(100 µM start, 3-fold dilution)로 IC50 산출..
4.4 Label-free LC/MS 검증
- SIRT1 0.14 µM, 화합물 10 µM에서 H3K9 acetylated peptide+NAD 반응을 RapidFire LC/MS로 측정하고 억제율 30% 이상을 유의 기준으로 둠.
4.5 Molecular dynamics simulation
- compound (1)을 NAD binding site에 docking(smina 사용) 후 100 ns 규모 MD로 결합 모드와 핵심 잔기 상호작용을 분석함
댓글