Integrated screening for small molecules interfering with PKM2: a drug repurposing strategy against glioblastoma

1.논문제목: Integrated screening for small molecules interfering with PKM2: a drug repurposing strategy against glioblastoma

2.저자명: Susan Costantini, Isabella Romeo, Giulia Fanelli, Maria Serena Roca, Gianmarco Gualtieri, Palmina Bagnara, Andrea Polo, Elena Di Gennaro, Francesco Ortuso, Stefano Alcaro, Alfredo Budillon, Gennaro Ciliberto, Marco G. Paggi, Claudia Abbruzzese

3.Publish: 2025 Dec 8

4.DOI: 10.1186/s12967-025-07444-9

5.Abstract

5-1 Background: Glioblastoma (GBM), the most aggressive adult brain tumor, remains a significant clinical challenge. Pyruvate kinase M2 (PKM2), by shifting between its tetrameric (metabolic) and dimeric (oncogenic) forms, drives GBM metabolism and tumorigenesis, regulating the Warburg effect. This study explores a drug repurposing strategy to identify clinically approved medications capable of stabilizing PKM2 in its tetrameric form, thus disrupting GBM metabolic adaptability and oncogenic potential.

5-2 Methods: We employed a multi-step screening strategy that integrates virtual screening, pharmacological data analysis, and in vitro cellular assays performed on anchorage‑dependent and ‑independent GBM cell lines. This methodological process highlights the potential of repurposable drugs to target a cancer‑specific metabolic vulnerability, thereby accelerating the development of novel therapeutic strategies for GBM.

5-3 Results: From thousands of clinically approved drugs, we selected, among those potentially able to cross the blood‑brain barrier, three candidates that significantly inhibited GBM cell viability, reduced PKM2 nuclear localization, and impaired glycolytic activity, suggesting their potential to attenuate the Warburg effect and tumor malignancy.

5-4Conclusions: We established a detailed screening protocol for drug repurposing to treat GBM. This approach targets a critical vulnerability of GBM cells by disrupting their bioenergetic balance. Since metabolic reprogramming and the associated Warburg effect are hallmarks of many cancers, not just GBM, we believe this approach holds significant potential for use against a wider range of tumors.

6.한글 초록 요약:

GBM은 가장 공격적인 성인 뇌종양으로 여전히 중요한 임상적 도전 과제임. 피루브산 키나제 M2(PKM2)는 사량체(대사적)와 이합체(종양발생적) 형태 사이를 전환하며 GBM 대사와 종양형성을 주도하고 Warburg 효과를 조절함. 본 연구는 PKM2를 사량체 형태로 안정화할 수 있는 임상 승인 약물을 찾아 GBM의 대사 적응성과 종양성을 저해하는 약물 재창출 전략을 탐구함. 가상 스크리닝, 약리학적 데이터 분석 및 고정식·비고정식 GBM 세포주에서 수행한 in vitro 세포 실험을 통합한 다단계 스크리닝 전략을 사용함. 이 방법론은 재창출 가능한 약물이 암 특이적 대사 취약점을 표적화하여 GBM에 대한 새로운 치료 전략 개발을 가속화할 수 있음을 보여줌. 수천 개의 임상 승인 약물 가운데 혈액‑뇌 장벽을 통과할 가능성이 있는 약물 중에서 GBM 세포의 생존을 현저히 억제하고 PKM2의 핵 내 위치를 감소시키며 해당작용을 저해하는 세 후보를 선별함. 이는 이러한 약물이 Warburg 효과와 종양 악성도를 약화시킬 수 있음을 시사함. GBM 치료를 위한 약물 재창출을 목표로 한 상세한 스크리닝 프로토콜을 마련함. 이 접근은 GBM 세포의 생물에너지 균형을 교란하여 중요한 취약점을 겨냥함. 대사 재프로그래밍과 Warburg 효과는 GBM뿐 아니라 여러 암의 특징이므로, 이 접근이 더 넓은 범위의 종양에 적용될 잠재력이 크다고 믿음

7.한글 논문 요약:

7-1. Introduction

GBM은 성인에서 가장 흔하고 공격적인 뇌종양으로, 수술과 방사선·화학요법을 포함한 표준 치료에도 불구하고 재발률이 높고 생존 기간이 14.6 개월에 불과한 임상적 도전과제임. 이러한 상황에서 기존 약물을 새로운 용도로 활용하는 약물 재창출 전략이 개발 기간을 단축하고 비용을 절감할 수 있어 주목받음. 연구진은 이전 연구에서 항정신병제인 클로르프로마진이 PKM2와 상호작용하여 사량체화를 촉진하고 Warburg 효과를 억제함을 발견했으며, 이를 바탕으로 PKM2를 표적화하는 추가 약물을 탐색하고자 함. PKM2는 포도당분해 경로의 핵심효소로, 사량체 상태에서는 PEP → 피루브산과 ATP 생성을 촉매하고, 이합체 상태에서는 핵으로 이동하여 유전자 전사 활성에 관여하여 암세포의 성장과 진화를 촉진함. 따라서 PKM2의 구조를 안정화하여 Warburg 효과를 역전시키는 약물을 발굴하는 것이 GBM 치료의 새로운 취약점을 공략하는 전략으로 제안됨.

7-2. Materials and methods

7-2-1 가상 스크리닝

연구진은 PKM2 활성제 NZT와 결합한 결정구조(PDB 4G1N)를 활용해 약 3391개의 FDA 승인 약물을 구조 기반 가상 스크리닝과 약동학 기반 스크리닝을 통해 분석함. 다양한 데이터베이스에서 수집한 화합물의 3D 구조를 에너지 최적화한 뒤, SwissADME·LogBB_Pred·OpenBabel 등 도구를 사용해 혈액-뇌 장벽 통과 가능성을 예측하고, Glide v.6.7과 AutoDock4.2.6을 이용해 PKM2 사량체의 알로스테릭 결합부위에 도킹하여 높은 결합에너지를 가지는 약물을 선별함. 또한 기존 PKM2 활성제의 약리학적 특징을 반영한 파마코포어 모델을 설정하여 추가 스크리닝을 수행함.

7-2-2 약리학 자료 검토

가상 스크리닝으로 도출된 41개 후보를 대상으로 허가 여부, 약물동력학·독성 정보, 약물 상호작용, 약물의 기전 및 임상 실험 현황을 종합적으로 검토하여 26개 화합물을 재창출 후보로 추렸음.

7-2-3 세포 기반 실험

네 가지 GBM 세포주(U‑87 MG, U‑251 MG, TS#1, TS#163)와 비종양 RPE‑1 세포를 사용해 후보 약물의 효과를 검증함. 세포 생존율 시험에서는 96‑well plate에 GBM 세포를 배양 후 약물 농도별로 48 시간 처리한 뒤 발광 기반 CellTiter‑Glo assay로 IC30·IC50 값을 산출하여, 26개 후보 중 9개 약물이 네 가지 세포주 모두에서 세포 생존을 유의하게 억제함을 확인함. 고내용 면역형광 분석에서는 PKM2의 핵 내 위치를 측정하기 위해 U‑87 MG와 U‑251 MG 세포 및 RPE‑1 세포에 후보 약물을 48 시간 처리하고 anti‑PKM2 항체와 형광 염색을 사용하여 핵 내 PKM2 양을 정량화함. Seahorse XFp 분석기를 통한 대사 분석에서는 선택된 약물이 포도당분해(f = glycoPER)와 산화적 인산화(OCR) 등 세포 대사 지표에 미치는 영향을 실시간으로 측정함. 통계적 유의성 평가는 Prism v10 소프트웨어로 수행하여 p < 0.05를 기준으로 의미 있는 차이를 판단함.

7-3. Results and Discussion

가상 스크리닝을 통해 41개 후보 약물이 도출되었으며, 약리학적 검토를 통해 26개로 줄임. 세포 생존율 시험에서 이들 가운데 9개 약물이 모든 GBM 세포주에서 IC50 농도 범위 내에서 생존을 현저히 억제하였음. 이후 고내용 형광 분석에서 이 9개 약물 중 5개가 PKM2의 핵 내 축적을 유의하게 감소시켜 CPZ와 유사한 패턴을 보였고, 이 효과는 비종양 RPE‑1 세포보다 GBM 세포주에서 더 뚜렷하게 나타남. Seahorse XFp 분석에서는 5개 약물 중 berotralstat, U‑73343, perphenazine 세 개가 U‑87 MG와 U‑251 MG 세포에서 급성 처리 후 glycolysis를 크게 억제하고 mitochondrial ATP production은 크게 변화시키지 않는 것으로 나타났음. 또한 ATP rate assay에서 U‑251 MG 세포는 기본적으로 해당작용 의존성이 높고, U‑87 MG 세포는 산화적 인산화 의존성이 높음을 확인하여 두 세포주의 대사 차이를 보여줌. 이러한 분석 과정을 통해 최종적으로 세 약물(berotralstat, U‑73343, perphenazine)이 PKM2 사량체화를 촉진하고 Warburg 효과를 약화시키며 GBM 세포의 악성도를 낮추는 유망한 후보로 선정됨.

7-4. Conclusions

본 연구는 약물 재창출을 위해 가상 스크리닝 → 약리학 검토 → 세포 생존 시험 → 형광 기반 페노타입 분석 → 대사 분석을 통합한 체계적 스크리닝 프로토콜을 구축함. 이 절차를 통해 세 가지 기존 약물이 PKM2의 사량체화를 촉진하여 GBM 세포의 Warburg 효과를 억제하고 대사 균형을 교란함으로써 세포 생존성을 감소시킨다는 것을 입증함. PKM2 사량체 안정화는 GBM뿐 아니라 다른 암에서도 공통적으로 나타나는 대사 취약점이므로, 본 연구에서 제시한 재창출 접근법은 보다 광범위한 종양 치료에 적용될 가능성이 큼. 추후 연구에서는 ZINC20 라이브러리 등 더 큰 화합물 풀을 대상으로 스크리닝을 확장하고, 선별된 약물의 기전과 효능을 in vitro·in vivo 모델에서 검증할 계획임.

8.대표 Figure: