A covalent allosteric molecular glue suppresses NRF2-dependent cancer growth
- 4일 전
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Roy N, Wyseure T, Lo IC, Lu J, Eissler CL, Bernard SM, Bok I, Snead AN, Parker A, Lo UG, Green JC, Inloes J, Jacinto SR, Kuenzi B, Pariollaud M, Negri K, Le K, Horning BD, Ibrahim N, Grabow S, Panda H, Bhatt DP, Wilkerson EM, Saeidi S, Zolkind P, Rush Z, Williams HN, Walton E, Pastuszka MK, Sigler JJ, Tran E, Hee K, McLaughlin J, Ambrus-Aikelin G, Pollock J, Abraham RT, Kinsella TM, Simon GM, Major MB, Weinstein DS, Patricelli MP.
Cancer Discov . 2025 Dec 19. doi: 10.1158/2159-8290.CD-25-1187
Abstract
The NRF2 transcription factor is constitutively active in cancer where it functions to maintain oxidative homeostasis and reprogram cellular metabolism. NRF2-active tumors exhibit NRF2-dependency and resistance to chemo/radiotherapy. Here we characterize VVD-065, a first-in-class NRF2 inhibitor that acts via an unprecedented allosteric molecular glue mechanism. In the absence of stress or mutation, NRF2 is rapidly degraded by the KEAP1-CUL3 ubiquitin-ligase complex. VVD-065 specifically and covalently engages Cys151 on KEAP1, which in turn promotes KEAP1-CUL3 complex formation, leading to enhancement of NRF2 degradation. Previously reported Cys151-directed compounds decrease KEAP1-CUL3 interactions and stabilize NRF2, thus establishing KEAP1_Cys151 as a tunable regulator of the KEAP1-CUL3 complex and NRF2 stability. VVD-065 inhibited NRF2-dependent tumor growth and sensitized cancers to chemo/radiotherapy, supporting an open Phase I clinical trial (NCT05954312).
연구배경
NRF2 전사인자는 정상 세포에서 KEAP1-CUL3 E3 ubiquitin ligase 복합체에 의해 지속적으로 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해가 이루어진다. 그러나 폐암, 식도암, 두경부암 등 다양한 고형암에서는 NRF2 gain-of-function 변이 또는 KEAP1 loss-of-function 변이로 인해 NRF2가 항상 활성화되어 있으며, 이는 산화적 항상성 유지, 대사 재프로그래밍, 면역 억제, 항암제 및 방사선 내성을 유발하는 주요 기전으로 알려져 있다. 전사인자라는 특성상 직접적인 약물 타겟으로 접근하기 어려웠기 때문에, 현재까지 임상에서 사용 가능한 NRF2 직접 억제제는 존재하지 않았다.
약물 발견 과정
Vividion Therapeutics는 자가면역질환 치료를 위한 NRF2 활성화제를 개발할 목적으로, KEAP1의 Cys151 잔기를 타겟으로 하는 공유결합성 소분자 화합물 라이브러리를 대규모 chemoproteomics 기반 스크리닝으로 평가하였다. 이 플랫폼은 세포 또는 세포 lysate에서 biotinylated iodoacetamide probe와의 경쟁적 결합을 mass spectrometry로 정량화하여, 특정 cysteine 잔기에 대한 화합물의 결합 효율(Target Engagement, TE)을 직접 측정하는 방식이다. 1차 스크리닝(>1,000종, 500 µM)과 2차 스크리닝(>500종, 50 µM)을 거쳐 VVD-944를 초기 hit으로 선정하였고, 이후 구조 최적화를 통해 VVD-325, VVD-330, VVD-446, VVD-860을 거쳐 최종적으로 VVD-065가 도출되었다.
스크리닝 초기에 KEAP1 Cys151에 강하게 결합하면서도 HEK293 ARE-Luciferase 리포터 assay에서 NRF2를 활성화시키지 않는 화합물이 발견되었고, 이를 NRF2가 활성화된 KYSE70 세포(NRF2 W24C 변이, 식도편평세포암)에서 검증한 결과 오히려 NRF2 전사 활성을 52% 억제하는 예상치 못한 결과를 얻었다. 이 발견을 기반으로 NRF2 억제 방향으로 최적화가 진행되었으며, VVD-065는 KYSE70 세포 내에서 KEAP1 Cys151에 대해 TE50 = 0.009 µM의 매우 강력한 결합력을 나타내었고, NRF2 단백질 감소 및 NRF2 표적 유전자 발현 억제를 유도하였다. 비활성 enantiomer인 VVD-064는 동일 조건에서 효과를 나타내지 않아 입체화학적 특이성이 확인되었다.
선택성 분석에서는 24,000개 이상의 cysteine 잔기를 포함한 proteome-wide cysteine profiling을 통해 VVD-065가 KEAP1 Cys151에만 거의 배타적으로 결합함이 확인되었으며, VVD-065 유도체 affinity probe를 이용한 단백질 수준의 선택성 분석에서도 KEAP1이 사실상 유일한 결합 단백질로 확인되었다.
작용 기전
VVD-065의 작용 기전을 규명하기 위해 KEAP1 BTB 도메인과 VVD-065의 복합체 결정 구조가 1.87 Å 해상도로 결정되었다(PDB ID: 9DU7). 구조 분석 결과, VVD-065는 acrylamide의 말단 탄소가 Cys151에 공유결합하고, chlorophenyl 기는 소수성 클레프트에 위치하며, triazine 기는 His129 및 His154와 π-stacking 상호작용을 형성하고, Arg135 측쇄와는 수소결합을 이루는 것이 확인되었다.
결정적으로 VVD-065 결합 시 KEAP1 BTB 도메인에 현저한 구조 변화가 유도되었다. Cys151의 rotamer가 기존 apo 구조 및 bardoxolone 결합 구조에서 관찰되는 m-rotamer(chi angle -65°)에서 p-rotamer(chi angle 55°)로 전환되고, 이 회전을 수용하기 위해 M147과 F52가 BTB 코어에서 밀려나며, helix-6 말단이 Cys151 방향으로 2.9 Å 이동하였다. 이 VVD-065 결합 구조는 KEAP1-CUL3 복합체 구조와 거의 일치하는 것으로 확인되어, VVD-065가 KEAP1을 CUL3 결합에 유리한 conformation으로 안정화시킨다는 가설이 제시되었다.
이 가설은 생화학적으로도 검증되었다. HTRF 기반 단백질-단백질 상호작용 분석에서 VVD-065는 KEAP1-CUL3 결합을 용량의존적으로 증가시켰으며, bardoxolone은 반대로 이 상호작용을 감소시켰다. 표면플라즈몬공명(SPR) 분석에서는 VVD-065가 KEAP1-CUL3 복합체의 해리 속도를 0.01 s⁻¹에서 4.3×10⁻⁴ s⁻¹로 감소시켜 결합 친화도를 10배 이상 증가시켰다(KD: 783 nM → 65 nM). 또한 VVD-065는 KEAP1-NRF2 직접 결합에는 영향을 주지 않으면서 NRF2의 polyubiquitination을 증가시켰으며, 이 효과는 CUL3 및 프로테아좀 활성에 의존적이었다.
따라서 VVD-065는 KEAP1 Cys151에 공유결합하여 allosteric 구조 변화를 유도하고, KEAP1-CUL3 복합체 형성을 안정화함으로써 NRF2 분해를 촉진하는 covalent allosteric molecular glue degrader로 정의된다. 이는 동일한 Cys151 부위에 결합하면서도 기존 KEAP1 inhibitor들과 정반대의 기능적 결과를 나타내는 최초의 사례이다.
VVD-065의 효과는 KEAP1과 NRF2 사이의 잔존 결합이 유지되는 경우에만 발휘된다. NRF2 고친화도 결합 motif인 ETGE를 파괴하는 NRF2 E79K 변이(LK2 세포)나 KEAP1-NRF2 결합을 완전히 차단하는 KEAP1 G333C 변이(A549 세포)에서는 VVD-065의 효과가 관찰되지 않았으며, 후자의 경우 CRISPR로 wild type KEAP1 allele로 교정하면 효과가 회복되었다.
한계 및 향후 방향
KEAP1-NRF2 결합을 완전히 차단하는 KEAP1 non-anchor 변이나 NRF2 ETGE motif 변이를 보유한 종양에서는 VVD-065의 효과가 발휘되지 않는다. 또한 KEAP1 promoter hypermethylation으로 인해 KEAP1 발현이 현저히 감소된 경우에도 효과가 제한될 수 있다. 저자들은 이러한 유전적 및 후성유전학적 변이들을 카탈로그화하여 반응 예측 biomarker를 정립하는 것이 향후 임상 적용을 위한 핵심 과제임을 강조하고 있다.
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