Synergism of non‑thermal plasma and low concentration RSL3 triggers ferroptosis via promoting xCT lysosomal degradation through ROS/AMPK/mTOR axis in lung cancer cells

1.논문 제목: Synergism of non‑thermal plasma and low concentration RSL3 triggers ferroptosis via promoting xCT lysosomal degradation through ROS/AMPK/mTOR axis in lung cancer cells

2.저자명: Shengjie Peng, Guodong Chen, K. N. Yu, Yue Feng, Lele Zhao, Miaomiao Yang, Wei Cao, Waleed Abdelbagi Ahmed Almahi, Mingyu Sun, Yuan Xu, Ye Zhao, Cheng Cheng, Fengqin Zhu, Wei Han.

3.Publish: 12 February 2024

4.DOI: 10.1186/s12964-023-01382-z

5.Abstract: Though (1S, 3R)-RSL3 has been used widely in basic research as a small molecular inducer of ferroptosis, the toxicity on normal cells and poor pharmacokinetic properties of RSL3 limited its clinical application. Here, we investigated the synergism of non-thermal plasma (NTP) and low-concentration RSL3 and attempted to rise the sensitivity of NSCLC cells on RSL3. Though (1S, 3R)-RSL3 has been used widely in basic research as a small molecular inducer of ferroptosis, the toxicity on normal cells and poor pharmacokinetic properties of RSL3 limited its clinical application. Here, we investigated the synergism of non-thermal plasma (NTP) and low-concentration RSL3 and attempted to rise the sensitivity of NSCLC cells on RSL3. We found the synergism of NTP and low-concentration RSL3 triggered severe mitochondria damage, more cell death and rapid ferroptosis occurrence in vitro and in vivo. NTP and RSL3 synergistically induced xCT lysosomal degradation through ROS/AMPK/mTOR signaling. Furthermore, we revealed mitochondrial ROS was the main executor for ferroptosis induced by the combined treatment. Our research shows NTP treatment promoted the toxic effect of RSL3 by inducing more ferroptosis rapidly and provided possibility of RSL3 clinical application

6.한글 초록 요약본: (1S, 3R)-RSL3는 ferroptosis를 유도하는 소분자 물질로 기초 연구에서 널리 사용되어 왔으나, 정상세포에 대한 독성과 좋지 않은 약동학적 특성 때문에 임상 적용이 제한되어 왔음. 본 연구에서는 non-thermal plasma(NTP)와 저농도 RSL3의 상승효과를 조사하고, NSCLC 세포의 RSL3 민감도를 높일 수 있는지 확인하고자 함. 세포 생존율 변화는 CCK-8 assay로 측정함. Lipid peroxidation, cell death, ROS level은 현미경 분석과 flow cytometry를 이용해 확인함. 분자 기전은 Western blot과 RT-qPCR로 분석함. 또한 xenograft mouse model을 이용해 NTP와 RSL3의 효과를 in vivo에서 평가함. NTP와 저농도 RSL3의 병합 처리는 in vitro와 in vivo에서 심한 mitochondrial damage, 더 많은 세포사멸, 빠른 ferroptosis 발생을 유도함. NTP와 RSL3는 ROS/AMPK/mTOR signaling을 통해 xCT lysosomal degradation을 상승적으로 유도함. 또한 병합 처리로 유도된 ferroptosis에서 mitochondrial ROS가 주요 executor임을 확인함. 본 연구는 NTP 처리가 더 빠르고 강한 ferroptosis를 유도함으로써 RSL3의 독성 효과를 증강시키며, RSL3의 임상 적용 가능성을 높일 수 있음을 보여줌.

7.한글 논문 요약본

7-1 Introduction: Non-thermal plasma(NTP)는 ROS, RNS, 전자, 이온, 자외선 등을 포함하는 ionized gas로, 암세포에서 산화 스트레스와 다양한 세포사멸을 유도할 수 있어 항암 치료 전략으로 주목받고 있음. Ferroptosis는 iron-dependent lipid peroxidation 축적을 특징으로 하는 조절성 세포사멸이며, 특히 기존 치료에 저항성을 보이는 암세포를 제거하는 데 중요한 가능성을 가짐. RSL3는 GPX4 inhibitor로 널리 사용되는 ferroptosis inducer이지만, 정상세포 독성과 낮은 약동학적 특성 때문에 임상 적용에는 한계가 있음. 본 연구는 낮은 농도의 RSL3를 NTP와 병합하여 NSCLC 세포에서 RSL3의 독성을 증강시키고, 정상세포 독성은 낮추면서 ferroptosis를 효과적으로 유도할 수 있는지 확인하고자 함. 특히 병합 처리에 의해 ROS/AMPK/mTOR axis가 활성화되고, xCT lysosomal degradation이 촉진되어 ferroptosis가 유도되는지를 규명하는 데 초점을 둠

7-2 Method: 연구진은 NSCLC 세포주 Calu-1, H1299, H1975, HCC827, A549, PC9과 정상 폐 세포주 WI38, HBE를 사용함. NTP 처리는 atmospheric pressure dielectric barrier discharge(DBD) plasma 장치를 이용해 수행했으며, helium gas를 working gas로 사용하고 노출 시간을 조절해 NTP dose를 설정함. 병합 처리에서는 세포를 저농도 RSL3로 4시간 전처리한 후 NTP를 처리함. 또한 NTP를 배지에 직접 노출시킨 plasma-activated medium(PAM)을 만들어 in vivo 실험에 사용함.

세포 생존율은 CCK-8 assay로 측정하고, 세포사멸은 Annexin V-FITC/PI staining과 flow cytometry로 분석함. Ferroptosis 여부는 Ferrostatin-1, Z-VAD-FMK, Nec-1s, chloroquine 등 세포사멸 억제제를 이용해 구분했으며, lipid peroxidation은 C11-BODIPY staining으로 확인함. 또한 transmission electron microscopy를 이용해 ferroptosis에서 나타나는 mitochondrial shrinkage, cristae 감소, membrane density 증가 등을 관찰함.

기전 분석을 위해 ROS scavenger인 NAC, H2O2 제거 효소인 catalase, mitochondrial ROS scavenger인 MitoTempo를 사용하여 ROS와 mitochondrial ROS의 역할을 확인함. Western blot과 RT-qPCR을 통해 GPX4, xCT, AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, P70S6K 등을 분석함. xCT의 역할은 β-mercaptoethanol 처리와 xCT overexpression으로 검증했고, xCT degradation 경로는 proteasome inhibitor인 MG132와 lysosome inhibitor인 NH4Cl을 비교하여 확인함. 마지막으로 Calu-1 xenograft mouse model에서 control, RSL3, PAM, PAM+RSL3 그룹을 비교해 종양 성장 억제 효과와 정상 조직 독성을 평가함.

7-3 Result: NTP와 RSL3는 각각 NSCLC 세포에서 dose-dependent 또는 concentration-dependent하게 세포 생존율을 낮춤. 연구진은 단독 처리 시 종양세포와 정상세포 모두에서 뚜렷한 독성이 없는 저농도 RSL3(0.1 μM)를 선택했고, 이 농도의 RSL3를 NTP와 병합했을 때 Calu-1, H1975, HCC827, H1299 등 NSCLC 세포에서 세포 생존율이 크게 감소함. 반면 정상 폐 세포인 WI38과 HBE에서는 병합 처리에 의한 뚜렷한 독성이 관찰되지 않음. 또한 병합 처리 후 세포사멸과 형태 변화가 빠르게 나타나, NTP가 낮은 농도의 RSL3 효과를 선택적으로 증강시킬 수 있음을 보여줌.

세포사멸 유형 분석에서는 ferroptosis inhibitor인 Ferrostatin-1만이 병합 처리에 의한 세포 생존율 감소를 회복시켰고, apoptosis, necrosis, autophagy 억제제는 회복 효과를 보이지 않음. 병합 처리군에서는 C11-BODIPY signal 증가를 통해 lipid peroxidation이 확인되었고, TEM 분석에서도 mitochondria shrinkage, cristae 감소, membrane density 증가 등 ferroptosis-associated morphology가 관찰됨. 따라서 NTP와 저농도 RSL3의 병합 처리는 NSCLC 세포에서 주로 ferroptosis를 유도하는 것으로 확인됨.

ROS 분석에서는 NAC가 병합 처리에 의한 세포사멸을 거의 정상 수준으로 회복시켜, ROS 증가가 핵심 원인임을 보여줌. Catalase로 PAM 내 H2O2를 제거하면 병합 처리 효과가 감소했고, 저농도 H2O2와 RSL3를 함께 처리했을 때 NTP+RSL3와 유사하게 lipid peroxidation과 세포사멸이 증가함. 그러나 RSL3를 세포 없는 배지에 첨가한다고 해서 NTP 처리 후 H2O2 양이 증가하지는 않았기 때문에, 병합 처리의 ROS 증가는 단순한 배지 내 화학반응이 아니라 세포 내부 반응에 의해 강화된 것으로 해석됨. 특히 MitoSOX Red 분석에서 mitochondrial ROS가 크게 증가했고, MitoTempo가 이를 억제하면서 세포 생존율도 회복시켜 mitochondrial ROS가 병합 처리 유도 ferroptosis의 주요 executor임을 보여줌.

기전적으로 병합 처리는 GPX4 activity를 NTP 단독보다 더 강하게 억제하지는 않았지만, xCT protein을 뚜렷하게 감소시키고 GSH level을 낮춤. β-mercaptoethanol 처리나 xCT overexpression은 병합 처리에 의한 세포 생존율 감소를 완화했기 때문에, xCT 기능 저하가 ferroptosis 유도에 중요함을 확인함. 흥미롭게도 xCT mRNA는 증가했지만 protein은 감소했으며, MG132는 xCT 감소를 회복하지 못한 반면 NH4Cl은 회복시킴. 이는 병합 처리 후 xCT가 proteasome이 아니라 lysosome-dependent degradation을 통해 감소함을 의미함.

신호전달 분석에서는 NTP+RSL3 처리 후 AMPK phosphorylation이 증가하고 mTORC1 pathway가 억제됨. NAC 처리는 AMPK activation, mTORC1 inhibition, xCT degradation을 모두 완화했으며, L-leucine은 xCT protein level을 증가시키고 rapamycin은 xCT 감소를 강화함. AMPK knockdown은 mTORC1 신호를 회복시켜, ROS 증가가 AMPK activation을 유도하고, 이어 mTORC1 억제와 xCT lysosomal degradation을 통해 ferroptosis가 유도되는 경로를 뒷받침함. In vivo Calu-1 xenograft model에서도 PAM+RSL3 병합 처리군은 PAM 또는 RSL3 단독군보다 종양 부피와 종양 증식 지표 Ki67을 더 뚜렷하게 감소시켰고, ALT, AST, BUN, UA 및 주요 장기 H&E staining에서 유의한 정상 조직 독성은 확인되지 않음.

7-4 Conclusion: 본 연구는 NTP와 저농도 RSL3 병합 처리가 NSCLC 세포에서 빠르고 강한 ferroptosis를 유도함을 보여줌. 저농도 RSL3 단독으로는 뚜렷한 독성이 낮고 NTP 단독 효과도 제한적이지만, 두 처리를 병합하면 mitochondrial ROS 증가, lipid peroxidation 축적, xCT 감소, GSH 고갈이 함께 나타나 ferroptosis가 촉진됨. 핵심 기전은 ROS 증가 → AMPK activation → mTORC1 inhibition → xCT lysosomal degradation → GSH 감소 및 lipid peroxidation 증가 → ferroptosis로 정리할 수 있음. In vivo에서도 PAM+RSL3 병합 처리는 Calu-1 xenograft 종양 성장을 억제하면서 주요 정상 조직 독성은 뚜렷하지 않았음. 따라서 NTP는 RSL3의 낮은 농도 사용을 가능하게 하고, RSL3의 정상세포 독성 및 약동학적 한계를 일부 보완할 수 있는 병합 치료 전략으로 제시됨.

8.대표 Figure