Repurposed pizotifen malate targeting NRF2 exhibits anti-tumor activity through inducing ferroptosis in esophageal squamous cell carcinoma
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1.논문 제목: Repurposed pizotifen malate targeting NRF2 exhibits anti-tumor activity through inducing ferroptosis in esophageal squamous cell carcinoma
2.저자명: Xinyu He, Yubing Zhou, Wenjing Chen, Xiaokun Zhao, Lina Duan, Hao Zhou, Mingzhu Li, Yin Yu, Jimin Zhao, Yaping Guo, Huihui Gu, Yanan Jiang, Zigang Dong, Kangdong Liu
3.Publish: 25 February 2023
5.Abstract: Targeted therapy attempts are needed to enhance esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) patients’ overall survival and satisfaction of life. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2), as a high-confidence cancer driver gene, controls the antioxidant response, metabolic balance and redox homeostasis in cancer and is regarded as a potent molecular target for cancer treatment. Here, we attempted to find a new NRF2 inhibitor and study the underlying molecular mechanism in ESCC. We found that up-regulated NRF2 protein was negatively correlated with patient prognosis and promoted tumor proliferation in ESCC. Moreover, Pizotifen malate (PZM), a FDA-approved medication, bound to the Neh1 domain of NRF2 and prevented NRF2 protein binding to the ARE motif of target genes, suppressing transcription activity of NRF2. PZM treatment suppressed tumor development in ESCC PDX model by inducing ferroptosis via down-regulating the transcription of GPX4, GCLC, ME1 and G6PD. Our study illustrates that the over expression of NRF2 indicates poor prognosis and promotes tumor proliferation in ESCC. PZM, as a novel NRF2 inhibitor, inhibits the tumor growth by inducing ferroptosis and elucidates a potent NRF2-based therapy strategy for patients with ESCC.
6.한글 초록 요약본: 표적 치료 전략은 식도 편평세포암(ESCC) 환자의 전체 생존율과 삶의 만족도를 향상시키기 위해 필요함. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(NRF2)는 높은 신뢰도의 암 driver gene으로서 암에서 항산화 반응, 대사 균형, 산화환원 항상성을 조절하며 암 치료의 강력한 분자 표적으로 여겨짐. 본 연구에서는 ESCC에서 새로운 NRF2 억제제를 찾고 그 기저 분자 기전을 규명하고자 함. 연구진은 NRF2 단백질의 증가가 환자 예후와 음의 상관관계를 보이며 ESCC에서 종양 증식을 촉진함을 확인함. 또한 FDA 승인 약물인 pizotifen malate(PZM)가 NRF2의 Neh1 domain에 결합하여 NRF2 단백질이 표적 유전자의 ARE motif에 결합하는 것을 막고 NRF2 전사활성을 억제함을 확인함. PZM 처리는 GPX4, GCLC, ME1, G6PD의 전사를 낮추어 ferroptosis를 유도함으로써 ESCC PDX 모델에서 종양 발달을 억제함. 본 연구는 NRF2 과발현이 ESCC에서 나쁜 예후를 나타내고 종양 증식을 촉진함을 보여줌. PZM은 새로운 NRF2 억제제로서 ferroptosis를 유도해 종양 성장을 억제하며, ESCC 환자를 위한 강력한 NRF2 기반 치료 전략을 제시함
7.한글 논문 요약본:
7-1 Inroduction: ESCC는 치료 발전이 제한적이고 5년 생존율이 낮아 새로운 치료 표적 발굴이 필요한 암종임. NRF2는 항산화 반응과 세포 스트레스 반응을 조절하는 전사인자로, 여러 암에서 과발현되어 암세포 증식, 전이, 항암·방사선 치료 저항성과 관련되는 것으로 알려져 있음. 특히 NRF2는 ESCC에서 과활성화되어 있다고 보고되었지만, ESCC에서의 구체적 기능과 NRF2 억제제 개발은 아직 충분하지 않음. 기존 NRF2 억제 후보들은 비특이적 작용 문제가 있고 임상 적용까지 이어지지 못했기 때문에, FDA 승인 약물 재창출 방식이 빠르고 실용적인 대안으로 제시됨. 본 연구는 ESCC에서 NRF2의 임상적 의미를 확인하고, FDA 승인 약물 중 pizotifen malate(PZM)를 NRF2 억제제로 발굴하여 ferroptosis 유도 기반 항종양 효과를 검증하고자 함.
7-2 Methods:
- 연구진은 ESCC 조직 microarray에서 IHC staining을 수행해 NRF2 단백질 발현을 확인하고, 환자 생존율·임상 병기·림프절 전이와의 관련성을 분석함. 또한 TCGA와 GTEx RNA-seq 데이터를 이용해 ESCA/ESCC에서 NRF2 mRNA 발현을 비교함.
- NRF2의 기능 검증을 위해 ESCC 세포주와 정상 식도 상피세포주 SHEE를 사용함. KYSE150·KYSE450에서는 CRISPR/Cas9으로 NRF2 knockout을 만들고, KYSE30·KYSE510에서는 NRF2 과발현 세포주를 만들어 세포 증식, colony formation, CDX mouse model에서 종양 성장 변화를 평가함.
- NRF2 억제제 발굴을 위해 FDA 승인 약물 라이브러리를 cytotoxicity assay와 protein-small molecule docking으로 선별함. 이후 PZM이 NRF2에 직접 결합하는지는 pull-down assay, SPR, CETSA로 검증했고, SPR에서 KD = 9.57 μM의 결합 친화도를 확인함.
- PZM의 작용 부위를 확인하기 위해 NRF2의 Neh1–Neh6 domain을 분리·정제하고 pull-down 및 Asp480 mutation assay를 수행함. 이어 CO-IP, EMSA, ARE-luciferase assay를 통해 PZM이 NRF2-sMaf heterodimer 형성, ARE 결합, NRF2 전사활성을 억제하는지 검증함.
- PZM의 항종양 효과는 MTT, soft agar assay, plate colony formation assay로 확인함. 추가로 label-free proteomics, GSEA, Western blot, immunofluorescence, qRT-PCR, ChIP-qPCR을 통해 PZM이 NRF2 하위 ferroptosis 관련 유전자 GPX4, GCLC, ME1, G6PD를 조절하는지 분석함.
- Ferroptosis 유도 여부는 ROS, GSH/GSSG ratio, MDA/TBARS assay 및 ferroptosis inhibitor rescue assay로 확인함. In vivo에서는 세 가지 ESCC PDX 모델과 종양 절제 후 residual model을 사용해 PZM의 종양 성장 억제 및 재발 억제 효과를 평가함.
7-3 Results and Discussion:
- NRF2는 ESCC 조직에서 인접 정상 조직보다 높게 발현되었고, NRF2 고발현군은 저발현군보다 생존율이 낮았음. Median survival time은 NRF2 low군 30개월, NRF2 high군 13개월로 나타났으며, NRF2 발현은 임상 병기 및 림프절 전이와 양의 상관관계를 보임.
- 기능적으로 NRF2는 ESCC의 종양 성장을 촉진함. NRF2 knockout은 KYSE150·KYSE450 세포의 증식과 colony formation을 억제했고, CDX model에서도 종양 부피와 무게를 감소시킴. 반대로 NRF2 과발현은 KYSE30·KYSE510 세포의 증식과 colony formation을 증가시킴.
- PZM은 NRF2에 직접 결합하는 새로운 억제제로 확인됨. PZM은 NRF2의 Neh1 domain, 특히 Asp480 부위와 관련된 결합을 보였고, NRF2-sMaf heterodimer 형성과 NRF2의 ARE motif 결합을 방해하여 NRF2 전사활성을 농도 의존적으로 억제함.
- PZM은 정상 식도 상피세포보다 ESCC 세포에서 더 강한 성장 억제 효과를 보였고, 세포 증식과 colony formation을 감소시킴. NRF2 knockout 세포에서는 PZM 민감도가 낮아져, PZM의 항증식 효과가 NRF2 표적화와 관련됨을 보여줌.
- Proteomics와 GSEA 결과, PZM 처리 후 NRF2 pathway는 downregulation되고 ferroptosis pathway가 enriched됨. PZM은 GPX4, GCLC, G6PD, ME1의 mRNA와 단백질 발현을 낮추고, NRF2가 해당 유전자 promoter의 ARE 영역에 결합하는 것을 감소시킴.
- PZM은 ROS와 lipid peroxidation을 증가시키고 GSH/GSSG ratio를 감소시켜 ferroptosis를 유도함. DFO, Trolox, Ferrostatin-1은 PZM 유도 세포사멸을 rescue했지만, necroptosis·apoptosis·autophagy 억제제는 rescue하지 못해 PZM이 주로 ferroptosis를 통해 작용함을 확인함.
- In vivo PDX 모델에서 PZM은 LEG34, EG20, LEG110 종양의 부피와 무게를 감소시킴. 100 mg/kg PZM 처리군의 평균 tumor growth inhibition rate는 각각 77.44%, 57.76%, 68.52%였으며, 종양 조직에서 GPX4, ME1, GCLC, G6PD, Ki67 발현도 감소함.
- 종양 절제 후 residual model에서도 PZM은 종양 재성장을 억제하고 tumor-free time을 연장함. 주요 장기 H&E staining에서 뚜렷한 조직학적 이상이 관찰되지 않아, 실험 조건에서 유의한 독성은 확인되지 않음.
7-4. Conclusions:
- 본 논문은 ESCC에서 NRF2가 높은 발현을 보이며 환자의 나쁜 예후, 임상 병기, 림프절 전이와 관련되고, 실제로 ESCC 세포 증식과 종양 성장을 촉진하는 oncogenic factor임을 보여줌. 따라서 NRF2는 ESCC에서 예후 예측 인자이자 치료 표적으로 볼 수 있음.
- 연구진은 FDA 승인 약물 스크리닝을 통해 migraine 예방약으로 사용되어 온 pizotifen malate(PZM)를 새로운 NRF2 억제제로 제시함. PZM은 NRF2의 Neh1 domain, 특히 Asp480 부위에 결합하여 NRF2-sMaf heterodimer 형성과 ARE motif 결합을 방해하고 NRF2 전사활성을 억제함. 그 결과 GPX4, GCLC, ME1, G6PD 전사가 감소하고, GSH 감소, ROS 증가, lipid peroxidation 증가를 통해 ferroptosis가 유도됨.
- in vitro 세포 실험과 in vivo PDX 및 residual tumor model에서 PZM은 ESCC 종양 성장을 효과적으로 억제했고, 절제 후 재성장 억제 가능성도 제시함. 논문은 PZM이 NRF2-high ESCC 환자에게 적용 가능한 약물 재창출 기반 치료 전략이 될 수 있음을 주장함.
8.대표 Figure:
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