Discovery of new LXRβ agonists as glioblastoma inhibitors

Hao Chen, Ziyang Chen, Zizhen Zhang, Yali Li, Shushu Zhang, Fuqiang Jiang, Junkang Wei, Peng Ding, Huihao Zhou, Qiong Gu, Jun Xu

2020 May 15

10.1016/j.ejmech.2020.112240

Abstract

Discovery and optimization of selective liver X receptor β (LXRβ) agonists are challenging due to the high homology of LXRα and LXRβ in the ligand-binding domain. There is only one different residue (Val versus Ile) at the ligand-binding pocket of LXRs. With machine learning methods, we identified pan LXR agonists with a novel scaffold (spiro[pyrrolidine-3,3′-oxindole]). Then, we figured out the mechanism of LXR isoform selectivity from co-crystal structures. Based on the mechanism and the new scaffold, LXRβ selective agonists were designed and synthesized. This led to the discovery of LXRβ agonists 4-7rr, 4e13 and 4-13rr with IC₅₀ values ranging from 1.78 to 6.36 μM against glioblastoma in vitro. Treatment with 50 mg/kg/day of 4-13 for 15 days significantly reduced tumor growth using an in vivo xenograft glioblastoma model.

한글초록 요약

LXRα와 LXRβ는 리간드 결합 도메인에서 높은 상동성을 가지며, 두 수용체 간 결합 포켓에서는 단 하나의 아미노산(Val 대 Ile)만 차이가 존재함. 이로 인해 선택적인 LXRβ 작용제를 발견하고 최적화하는 데 어려움이 있음. 본 연구에서는 머신러닝 기반 접근법을 활용하여 spiro[pyrrolidine-3,3′-oxindole] 구조를 갖는 pan-LXR 작용제를 발굴하였음. 이후 공동결정 구조 분석을 통해 LXR isoform 선택성의 기전을 규명하였음. 이 기전과 신규 스캐폴드를 기반으로 LXRβ 선택적 작용제를 설계하고 합성하였으며, 이 중 4-7rr, 4e13, 4-13rr은 1.78~6.36 μM 범위의 IC50 값을 나타냄. 특히 4-13을 50 mg/kg/day 용량으로 15일간 처리하였을 때, 생쥐 이식성 교모세포종 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제함.

한글 논문 요약

1. Introduction

- Liver X receptors (LXRα, LXRβ) 는 핵 수용체로, 지질 대사, 염증, 신경질환 등에 관여.

- LXRβ는 광범위한 조직에 발현되며, GBM(교모세포종) 치료의 타깃으로 주목받음.

- GBM 세포는 외부 콜레스테롤에 의존하며, LXRβ 작용제를 통해 콜레스테롤 대사를 교란시키면 세포 사멸 유도 가능.

- LXRβ 선택적 작용제 개발의 어려움: LXRα/β는 리간드 결합 도메인(LBD)이 매우 유사(단 하나의 아미노산 차이).

- 본 연구의 목표: 1) Machine learning 기반 스크리닝을 통해 LXR 작용제 발굴, 2) 결정 구조 분석으로 LXRβ 선택성 기전 규명, 3) 약물 디자인 및 최적화 → 항암 효과 확인

2. Methods

2.1. Hit Discovery (Machine Learning Screening)

- ChEMBL, BindingDB에서 LXR 리간드 964개 수집.

- SVM, Naïve Bayes 모델 학습 → 내부 라이브러리 9500개 화합물 스크리닝.

- 13개 유효 LXR 작용제 확보.

2.2. Structure-Based Drug Design

- 대표 화합물 4ss의 공결정 구조(PDB: 6K9H) 분석.

- Chamber A/B 개념 도입 → selectivity는 Chamber B의 compactness에 좌우됨.

- fragment-based 디자인으로 LXRβ 선택성 강화 구조 도출.

2.3. 합성

- spiro[pyrrolidine-3,3′-oxindole] 스캐폴드 기반 합성 경로 확립.

- 총 20종 이상 합성, chiral HPLC로 R,R/S,S 이성질체 분리 및 확인.

2.4. Biological Assays

- Luciferase 리포터로 LXR 활성 측정.

- U87EGFRvIII 등 GBM 세포주에서 IC₅₀ 측정.

- 콜레스테롤 대사 관련 유전자 발현, uptake/efflux 실험, siRNA knockdown, in vivo xenograft 분석 등 실시.

2.5. Pharmacokinetics

- SD rat에서 약물 투여 후 LC-MS 분석으로 T₁/₂, Cₘₐₓ, AUC 계산.

3. Results

3.1. Novel Scaffold Discovery

- 13개 LXR 작용제 중 spiro-구조를 가진 4, 5, 13번 화합물이 주목됨.

- 4ss는 비선택적이지만, 4rr/4ss 이성질체 분리 → 4ss가 더 강한 활성 보임.

3.2. LXRβ Selectivity Mechanism

- 61X (LXRβ 선택적) 와 비교 시, Chamber B의 residue 간 상호작용 및 압축성(compactness)이 선택성의 핵심.

- salt bridge, 수소결합, π-π stacking이 중요한 요소.

3.3. Lead Optimization

- Hydrophilic/hydrophobic fragment 도입 → 4-7rr, 4-13rr 등 디자인 및 합성.

- R,R 이성질체가 대부분 S,S보다 더 높은 선택성과 GBM 억제능 보임.

3.4. Biological Activity

- 4-13rr: U87EGFRvIII 세포주에서 IC₅₀ = 1.78 μM → LXR-623보다 우수

- 콜레스테롤 유전자(ABCA1, IDOL 등) 발현 증가, 콜레스테롤 efflux 증가 및 세포 사멸 유도.

3.5. In Vivo 효과

- 4e13 투여 시 GBM xenograft 마우스 모델에서 종양 크기 감소, 체중 회복, 부작용(중성지방 증가) 최소화

4. Discussion

- Machine learning과 구조 기반 설계를 결합한 접근은 기존 scaffold hopping 한계를 극복.

- binding site의 compactness와 상호작용 층 구조 변화가 isoform 선택성의 핵심.

- 설계된 LXRβ 작용제들은 기존 약물보다 우수한 선택성(SI 최대 5.0) 및 항암효과를 보임.

- R,R-이성질체의 LXRβ 선택성이 구조 및 결합 분석을 통해 설명됨.

- GBM 치료 외에도 다른 LXRβ 관련 질환에 응용 가능성 있음.

5. Conclusion

- 본 연구는 기계학습 기반 스크리닝 + 결합 포켓 구조 분석 + SAR 최적화를 통해 선택적 LXRβ 작용제 개발 전략을 제시함.

- binding pocket의 구조적 compactness는 향후 isoform 선택적 약물 설계의 새로운 기준이 될 수 있음.