ARE-PROTACs Enable Co-degradation of an Nrf2–MafG Heterodimer

Ji J, Ma S, Zhu Y, Zhao J, Tong Y, You Q, Jiang Z. ARE-PROTACs Enable Co-degradation of an Nrf2-MafG Heterodimer. J Med Chem. 2023 May 11;66(9):6070-6081. doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c01909.

Proteolysis-targeting chimera (PROTAC) technology has emerged as a potential strategy to degrade “undruggable” proteins in recent years. Nrf2, an aberrantly activated transcription factor in cancer, is generally considered undruggable as lacking active sites or allosteric pockets. Here, we constructed the chimeric molecule C2, which consists of an Nrf2-binding element and a CRBN ligand, as a first-in-class Nrf2 degrader. Surprisingly, C2 was found to selectively degrade an Nrf2–MafG heterodimer simultaneously via the ubiquitin–proteasome system. C2 impeded Nrf2-ARE transcriptional activity significantly and improved the sensitivity of NSCLC cells to ferroptosis and therapeutic drugs. The degradation character of ARE-PROTACs suggests that the PROTAC hijacking the transcription element of TFs could achieve co-degradation of the transcription complex.

단백질 분해 표적화 키메라(PROTAC) 기술은 최근 "undruggable"(약물화 불가능) 단백질을 분해하기 위한 유망한 전략으로 부상해 왔다. 암에서 비정상적으로 활성화되는 전사인자인 Nrf2는 활성 부위나 알로스테릭 포켓이 없어 일반적으로 undruggable로 간주된다. 본 연구에서는 Nrf2 결합 요소와 CRBN 리간드로 구성된 키메라 분자 C2를 최초의(first-in-class) Nrf2 degrader로 제작하였다. 놀랍게도 C2는 유비퀴틴–프로테아좀 시스템을 통해 Nrf2–MafG 이형이합체를 선택적으로 동시에 분해하는 것으로 나타났다. C2는 Nrf2-ARE 전사 활성을 유의하게 억제하였으며, 비소세포폐암(NSCLC) 세포의 페롭토시스 및 치료 약물에 대한 감수성을 향상시켰다. 이러한 ARE-PROTAC의 분해 특성은, 전사인자의 전사 요소(transcription element)를 hijacking하는 PROTAC이 전사 복합체의 공동분해(co-degradation)를 달성할 수 있음을 의미한다

Introduction

NRF2(NFE2L2)는 CNC-bZip 계열 전사인자로, Neh1 도메인을 매개로 sMaf 단백질(MafG/MafF/MafK)과 이형이합체를 형성하여 ARE(consensus 5′-TGAG/CNNNGC-3′, CsMBE라고도 명명됨)를 인식하고 세포보호 유전자군의 전사를 구동한다. 그러나 KEAP1 또는 NFE2L2 변이 등에 의한 NRF2의 구성적 활성화는 산화환원 항상성 유지, 대사 재프로그래밍, 페롭토시스 저항, 화학요법 내성에 기여하며 불량한 예후와 연관된다. NRF2는 촉매 부위나 알로스테릭 포켓이 부재하여 전형적 저분자 표적화가 어려운 "undruggable" 전사인자로 간주되어 왔다. 본 연구에서는 표적 결합 리간드 확보의 난점을 우회하기 위해, TF의 내재적 DNA 결합 특이성을 활용하는 DNA 기반 PROTAC 계열(TF-PROTAC, TRAFTAC, O′PROTAC)의 전략을 채택하여, ARE 서열 자체를 NRF2 워헤드로 사용하는 ARE-PROTAC 개념을 제안한다.

Design and Synthesis

NRF2 표적화 리간드로는 인간 NQO1 유전자 프로모터의 −467 ~ −447 영역에서 유래한 21-mer 이중가닥 올리고뉴클레오타이드(5′-TCACAGTGACTCAGCAGAATC-3′)를 선정했다. NQO1은 NRF2 의존적 전사 표적으로, 해당 프로모터가 NRF2–sMaf 이합체가 결합하는 기능적 ARE를 포함한다는 점에 근거한 선택이다. 합성은 모듈식 병렬 전략을 취했다. 말단 알카인으로 수식한 ARE 올리고(Nrf2-DNA)와, 말단 아자이드 링커로 수식한 E3 리간드를 Cu(I) 촉매 azide–alkyne 고리화첨가 반응(CuAAC)으로 접합했다. E3 리간드는 CRBN을 동원하는 lenalidomide와 VHL을 동원하는 VH032 두 계열을 사용했으며, 링커의 길이·조성을 변주하여 CRBN 기반 C 시리즈(C1–C4)와 VHL 기반 V 시리즈(V1–V4)를 확보했다. DNA-PAGE로 접합 효율을 모니터링한 결과 24시간에서 약 100%의 전환을 확인했고, 제조용 액체크로마토그래피로 정제했다. A549(NRF2 구성적 활성 NSCLC 세포주)에서 리포솜 매개 도입 후 스크리닝한 결과, CRBN 기반 C 시리즈가 VHL 기반보다 NRF2 하향을 효과적으로 유도하여 생산적 삼중복합체 형성에 유리함을 확인하였다.

Ubiquitin–Proteasome 의존적 NRF2 분해 (A549)

C 시리즈 중 C2가 최적 degrader로, DC50 = 1.85 nM의 NRF2 분해능을 보였다. 시간경과 분석에서 분해는 7시간에 개시되어 48시간까지 지속되었다. 기전 검증을 위해 E3 결합능을 제거한 C2(−)-1과 NRF2 결합능을 제거한 C2(−)-2를 설계했고, 두 대조군 모두 분해능을 상실하여 NRF2 및 CRBN 양측 결합이 필수적임을 입증했다. CRBN siRNA 및 유리 Nrf2-DNA 경쟁 실험에서도 동일한 결론이 도출되었다. 분해는 NEDD8 활성화효소(NAE) 억제제 MLN4924(cullin-RING 리가아제 neddylation 차단)와 프로테아좀 억제제 MG132에 의해 완전히 차단되었으며, MG132 존재 상태에서 immunoprecipitation에서 폴리유비퀴틴화된 NRF2의 축적이 관찰되었다. 세포질 및 핵 분획 모두에서 NRF2가 농도 의존적으로 감소하여, ARE-PROTAC이 CRBN 기반 UPS를 경유해 NRF2를 분해함을 확립했다.

전사 억제 및 산화 스트레스 유도

C2 처리는 NRF2–MafG 표적 세포보호 유전자 HO-1, NQO1, GCLC를 mRNA 및 단백질 수준에서 농도 의존적으로 하향시켰다. 항산화 지표 분석에서 총 GSH 및 GSH/GSSG 비가 270 nM에서 현저히 감소하고 세포내 ROS가 유의하게 증가하여, NRF2 기능 저해에 따른 항산화 역량 붕괴와 산화적 손상 축적을 확인했다.

페롭토시스 감수성 증대

NRF2 표적이자 페롭토시스 핵심 조절인자인 GPX4가 mRNA·단백질 수준에서 하향되었고, NRF2 조절 페롭토시스 관련 유전자 SLC7A11, AKR1B1, FTL1, FTH1도 함께 감소했다. FerroOrange 프로브로 측정한 유리 Fe²⁺, 지질 과산화 지표 MDA 및 LiperFluo 형광, 페롭토시스 마커 PTGS2가 모두 증가하였다. Erastin 및 RSL3 유도 조건에서 C2는 ROS 및 세포사멸을 유의하게 증폭했고, 페롭토시스 특이 억제제 ferrostatin-1(Fer-1)으로 상쇄되어, C2가 NRF2 기능 억제를 통해 페롭토시스 감수성을 증대시킴을 확립했다.

화학요법 감수성 증대 및 항종양 효과

C2는 단독 처리에서 NSCLC 세포주 증식을 억제했다(IC50: A549 16.48 nM, H647 26.10 nM, H460 37.10 nM). NRF2 배경 발현이 낮은 정상 폐상피주 BEAS-2B에서는 유의한 억제가 관찰되지 않아 NRF2 활성 의존적 선택성을 확인하였다. 클론원성 분석에서 콜로니 형성이 농도 의존적으로 감소했으며, ErbB 억제제 afatinib, ALK 억제제 crizotinib, MEK1 억제제 trametinib, doxorubicin과의 병용에서 단독 대비 증대된 세포독성과 콜로니 감소가 확인되었다(HCT-116·MCF-7·PANC-1에서도 재현). NRF2가 phase II 해독효소, 약물 배출 수송체 및 MRP1–6 등 다중 내성 기전과 기능적으로 연결된다는 점이 이러한 감작 효과의 기전적 근거로 제시된다.

Conclusions

본 연구는 TF의 내재적 DNA 결합 특이성을 워헤드로 활용하여 최초의 NRF2 degrader(ARE-PROTAC)를 설계 및 검증하였다. 핵심 개념적 기여는, 전사 요소(ARE)를 hijacking하는 PROTAC이 해당 요소에 결합하는 이합체 파트너(MafG)를 포함한 전사복합체의 분해로 ARE-PROTAC은 NRF2 기능 억제를 통해 페롭토시스 및 화학요법 감수성을 증대시켰으며, NRF2 표적 분해 치료제 개발의 방법론적 토대를 제공한다.