Activation of the NRF2 antioxidant program sensitizes tumors to G6PD inhibition

1.논문 제목: Activation of the NRF2 antioxidant program sensitizes tumors to G6PD inhibition

2.저자명: Hongyu Ding, Zihong Chen, Katherine Wu, Shih Ming Huang, Warren L. Wu, Sarah E. LeBoeuf, Ray G. Pillai, Joshua D. Rabinowitz, Thales Papagiannakopoulos.

3.발행일: Science Advances,17 Nov 2021

4.DOI: 10.1126/sciadv.abk1023

5.Abstract: The KEAP1/NRF2 signaling pathway is frequently activated in cancer and promotes antioxidant defense and metabolic adaptation. To identify metabolic vulnerabilities associated with NRF2 activation, the authors performed a metabolism-focused CRISPR screen and discovered that glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is a critical dependency in KEAP1-mutant tumors. Surprisingly, loss of G6PD did not primarily impair antioxidant capacity or nucleotide synthesis. Instead, G6PD inhibition depleted tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates through increased activity of alternative NADPH-producing enzymes, including malic enzyme (ME1) and isocitrate dehydrogenase (IDH1). This metabolic disruption selectively suppressed growth of KEAP1-mutant tumors in vitro and in vivo. Furthermore, combining G6PD inhibition with glutaminase inhibition enhanced TCA depletion and produced stronger antitumor effects. These findings reveal a metabolic vulnerability of NRF2-activated cancers and suggest G6PD as a therapeutic target.

6.한글 초록 요약본: EAP1/NRF2 경로는 암세포의 산화스트레스 방어와 대사 재편성을 촉진하는 중요한 신호전달 체계이다. 연구진은 NRF2가 활성화된 암세포의 대사적 취약점을 찾기 위해 대사 유전자 중심의 CRISPR 스크리닝을 수행하였고, 그 결과 G6PD가 주요 의존성 유전자임을 확인하였다. G6PD는 산화적 오탄당인산경로(PPP)의 핵심 효소로 알려져 있으나, G6PD 억제에 따른 성장 억제 효과는 항산화 능력 저하나 뉴클레오타이드 생성 감소 때문이 아니었다. 대신 G6PD 결손은 IDH1과 ME1의 활성 증가를 유도하여 TCA cycle 중간체를 고갈시켰고, 이로 인해 KEAP1 변이 종양의 성장이 선택적으로 억제되었다. 또한 글루타미나아제 억제제(CB-839)와 병용 시 종양 억제 효과가 더욱 증가하였다. 본 연구는 NRF2 활성 암세포에서 G6PD가 새로운 치료 표적이 될 수 있음을 제시한다.

7.한글 논문 요약:

7-1.Introduction: NRF2는 세포 내 활성산소종(ROS)으로부터 세포를 보호하는 대표적인 전사인자로, 글루타티온 대사, NADPH 생성, 해독 효소 발현 등을 조절하여 산화환원 항상성을 유지한다. 암세포에서는 NRF2가 과도하게 활성화되는 경우가 많으며, 특히 KEAP1 유전자 변이가 발생하면 NRF2 분해가 억제되어 지속적인 NRF2 활성화가 일어난다. 이러한 변화는 암세포의 증식과 생존을 촉진하고 항암제, 방사선치료, 면역치료에 대한 저항성을 증가시킨다.NRF2 활성화는 포도당과 글루타민 대사를 재편성하여 PPP, glutaminolysis, serine synthesis pathway를 증가시킨다. 특히 PPP의 속도 결정효소인 G6PD는 NADPH와 리보스-5-인산을 생성하여 항산화 방어 및 핵산 합성을 지원하는 것으로 알려져 있다. 그러나 기존 연구에서는 G6PD가 KRAS 유도 폐암의 성장에 필수적이지 않은 것으로 보고되어 PPP의 실제 종양 의존성에 대한 논란이 존재하였다. 이에 본 연구에서는 KEAP1 변이를 가진 폐선암에서 특이적인 대사 취약점을 찾기 위해 대사 유전자 CRISPR 스크린을 수행하였다. 연구진은 G6PD가 KEAP1/NRF2 활성 종양에서 선택적으로 필수적이라는 사실을 발견하였고, 그 기전을 규명하고자 하였다.

7-2.Methods: 연구진은 먼저 KRAS/p53 변이 마우스 폐선암 세포(KP)와 NRF2 활성화 세포(KP+KI)를 이용하여 약 3,000개의 대사 관련 유전자를 대상으로 CRISPR/Cas9 스크리닝을 수행하였다. 후보 유전자로 선별된 G6PD에 대해 sgRNA 기반 knockout과 shRNA knockdown을 실시하여 기능을 검증하였다. 이후 인간 및 마우스 폐암 세포주에서 G6PD 결손 또는 G6PD 억제제(G6PDi-1)를 처리하여 세포 증식, 생존율, NADPH 수준, ROS 생성, 대사체 변화를 평가하였다. 또한 U-13C glucose 및 U-13C glutamine tracing을 이용하여 대사 흐름을 분석하였으며 LC-MS 기반 metabolomics를 수행하였다. 동물실험에서는 피하 이식 종양 모델과 GEMM(Genetically Engineered Mouse Model)을 이용하였다. KEAP1 변이 및 정상 종양에 G6PD를 제거하거나 억제한 후 종양 성장 변화를 비교하였다. 추가로 glutaminase 억제제 CB-839와 G6PD 억제의 병용 효과를 평가하여 치료 가능성을 확인하였다.

7-3.Results:

 7-3-1. CRISPR 스크린에서 G6PD가 NRF2 활성 종양의 필수 유전자로 확인

대사 유전자 CRISPR 스크린 결과 G6PD는 NRF2 활성화 세포에서 가장 강한 synthetic lethal 후보 중 하나로 확인되었다. G6PD를 제거하면 KEAP1 변이 또는 NRF2 활성 세포의 증식이 현저히 감소하였으나 KEAP1 정상 세포에서는 영향이 상대적으로 적었다. 이러한 현상은 인간 폐암 세포주에서도 동일하게 관찰되었으며, G6PD 억제제 처리 시에도 KEAP1 변이 세포가 더 높은 민감성을 나타냈다.

 7-3-2. 성장 억제는 ROS 증가 때문이 아님

일반적으로 G6PD는 NADPH 생성과 항산화 기능에 중요하지만, G6PD 결손 후에도 ROS 수준과 GSH/GSSG 비율은 크게 변화하지 않았다. 또한 NAC, Trolox 등의 항산화제나 뉴클레오타이드 전구체를 공급해도 세포 성장 저하는 회복되지 않았다. 이는 G6PD 의존성이 단순한 항산화 기능 때문이 아님을 의미한다.

7-3-3. G6PD 결손은 TCA cycle 중간체 고갈을 유도

Pyruvate, α-ketoglutarate, glutamate, aspartate 등 TCA cycle을 보충하는 대사체를 처리하면 G6PD 결손에 의한 성장 억제가 회복되었다. 대사체 분석 결과 citrate, α-ketoglutarate, malate 등 주요 TCA 중간체가 현저히 감소하였으며, 산소 소비율(OCR)도 감소하였다. 이는 G6PD 결손이 에너지 대사와 중심 탄소대사를 붕괴시킨다는 것을 보여준다.

 7-3-4. NRF2 활성화 세포에서 IDH1과 ME1이 TCA 고갈을 유발

KEAP1 변이 세포에서는 NRF2에 의해 IDH1과 ME1 발현이 증가되어 있었다. G6PD가 제거되면 세포는 부족한 NADPH를 보충하기 위해 IDH1과 ME1 활성을 더욱 증가시키는데, 이 과정에서 TCA cycle 중간체가 지속적으로 소비된다. 결과적으로 TCA cycle 고갈이 심화되어 세포 증식이 억제된다.

 7-3-5. G6PD는 KEAP1 변이 종양의 in vivo 성장에 필수

마우스 이식 종양 모델과 폐암 GEMM 모델 모두에서 G6PD 제거는 KEAP1 변이 종양의 성장을 현저히 억제하였다. 반면 KEAP1 정상 종양에서는 영향이 제한적이었다. 특히 G6PD를 완전히 제거한 경우 KEAP1 결손이 갖는 종양 촉진 효과가 거의 사라졌다.

  7-3-6. G6PD 억제와 Glutaminase 억제 병용 시 강력한 항암 효과

Glutaminase 억제제 CB-839는 TCA cycle로 유입되는 glutamine 대사를 차단한다. G6PD 억제와 CB-839를 병용하면 TCA 중간체 고갈이 더욱 심해져 세포 생존율이 크게 감소하였다. 마우스 모델에서도 병용군은 단독 처리군보다 현저한 종양 성장 억제 효과를 보였다. 따라서 G6PD 억제와 glutaminase 억제의 병용은 KEAP1 변이 폐암의 유망한 치료 전략으로 제시되었다.

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